高迁移率族蛋白1在醛固酮诱导肾小管上皮细胞自噬中的作用

毛楠，林定彪，马欣，陈鸿禧，周琬秋，王少清△

慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）是威胁人类健康的重大疾病之一，已经成为全球性公共健康问题，其发病率、致残率和病死率高，给个人、家庭及社会造成极大的经济负担。醛固酮（aldosterone，ALDO）是CKD进展的一个关键递质，直接参与肾小管损伤及肾脏纤维化的发生和发展。笔者既往研究发现，ALDO可促进大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的释放，通过AMPK/mTOR信号通路诱导NRK-52E细胞发生自噬［1］。大量研究证实，高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）与细胞自噬存在密切的关系［2］。HMGB1作为一种新型的炎性细胞因子，广泛分布于淋巴组织、心、肝、肺、脾、肾、脑等组织中，其本身很少或者无促炎症活性，但当它与炎症介质结合时，可激活和趋化炎症细胞，诱导大量炎症因子的分泌和释放，进而激发一系列炎症反应［3］。笔者推测HMGB1可能是ALDO诱导NRK-52E细胞自噬的重要中介因素。本研究拟采用ALDO致肾小管上皮细胞损伤模型，探讨HMGB1在ALDO诱导NRK-52E细胞自噬中的作用，为慢性肾脏病的防治提供新靶点和新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）购自中科院干细胞库/干细胞技术平台，课题组既往研究已验证该细胞的生物学特性［1］。

1.1.2 药物与试剂 醛固酮、N-乙酰半胱氨酸（美国Sigma公司）；DMEM培养基、10%胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；兔抗大鼠白细胞介素（IL）-1β多克隆抗体、兔抗大鼠LC3B多克隆抗体、兔抗大鼠Beclin-1多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（美国CST公司）；兔抗HMGB1多克隆抗体，兔抗p62多克隆抗体（英国Abcam公司）；兔抗大鼠β-actin单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）；2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）活性氧荧光探针试剂盒（上海碧云天生物有限公司）。

1.1.3 主要仪器 细胞培养箱（美国Thermo公司）；无菌操作台（德国Heraeus公司）；流式细胞仪（FACSAria，美国BD Bioscience公司）；冷冻离心机（德国SORVALL-fresco公司）；高速低温台式离心机（德国Heraeus公司）；垂直/水平电泳槽（上海天能）；水平电泳仪、Trans-blot电转移槽、图像采集与分析仪（美国Bio-rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，细胞于37℃、5%CO2培养箱中培养，每2～3 d传代1次，待细胞融合至80%时，改为无血清DMEM培养基饥饿24 h，使其生长同步化后进行以下实验。

1.2.2 ROS检测 将密度为1.0×105个/孔的NRK-52E细胞接种在6孔板中过夜，分为Control组、ALDO组（加入ALDO 10 nmol/L）、HMGB1抗体组（加入1 mg/L HMGB1）、IgG组（加入1 mg/L IgG）、ALDO+HMGB1抗体组（1 mg/L HMGB1抗体预处理1 h，再加入10 nmol/L ALDO）和阳性对照组（加入活性氧供氢体Rosup100µmol/L），以上各组均干预24 h，每组3个复孔。取10µL DCFH-DA探针，用20 mL无血清培养液稀释DCFH-DA探针，使其终浓度为5µmol/L。收集上述各组干预24 h后的细胞，悬浮于1 mL稀释好的DCFH-DA中，37℃细胞培养箱内孵育30 min（每隔3～5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触）；用无血清DMEM细胞培养基洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA；应用流式细胞仪488 nm激发波长，525 nm发射波长检测NRK-52E细胞的ROS水平。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的2'，7'-二氯荧光素（2',7'-Dichlorofluorescein,DCF），绿色荧光强度与细胞内ROS水平成正比，即细胞内ROS水平=DCF荧光强度。

1.2.3 Western blot检测IL-1β蛋白的表达 此部分实验设Control组、ALDO组（加入10 nmol/L ALDO）、NAC组（加入50µmol/L NAC）、NAC+ALDO组（50µmol/L NAC预处理NRK-52E细胞1 h后，再加入10 nmol/L ALDO），各组均干预24 h，每组3个复孔。收集各实验组细胞后提取蛋白，BCA法测蛋白浓度。将40µg总蛋白提取液与4×SDS缓冲液混匀，100℃加热变性8 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入兔抗大鼠IL-1β多克隆抗体（1∶1 000），4℃过夜；TBST缓冲液漂洗8 min×3次；加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（1∶6 000），37℃孵育2 h，TBST缓冲液清洗5 min×3次，避光加入ECL发光剂，X线常规显影、定影并进行灰度分析。

1.2.4 ALDO对NRK-52E细胞HMGB1蛋白表达的影响 取对数生长期的NRK-52E细胞，分为Control组和ALDO组（10 nmol/L），干预24 h后提取蛋白，BCA法测蛋白浓度。将40µg总蛋白提取液与4×SDS缓冲液混匀，100℃加热变性8 min，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入兔抗HMGB1多克隆抗体（1∶1 000），4℃过夜；TBST缓冲液漂洗8 min×3次；加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（1∶6 000），37℃孵育2 h，TBST缓冲液清洗5 min×3次，避光加入ECL发光剂，X线常规显影、定影并进行灰度分析。

1.2.5 阻断HMGB1对ALDO诱导NRK-52E细胞自噬的影响 此部分实验设为Control组、ALDO组（加入10 nmol/L ALDO）、HMGB1抗体组（加入1 mg/L HMGB1抗体）和ALDO+HMGB1抗体组（1 mg/L HMGB1抗体预处理1 h后，再加入10 nmol/L ALDO），各组均干预24 h，参照1.2.4中的步骤，Western blot法检测LC3-Ⅱ、Beclin-1和p62蛋白的表达。

1.3 统计学方法 实验重复3次，所有结果均采用SPSS 22.0统计软件处理，计量资料用x±s表示，两样本均数比较采用t检验，独立的多样本均数的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，两因素水平的样本均数比较采用析因方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 醛固酮可诱导NRK-52E细胞内ROS产生增加 流式细胞仪检测结果显示，与Control组比较，ALDO组、ALDO+HMGB1抗体组和Rosup组ROS水平明显升高（P＜0.05）；与ALDO组比较，HMGB1抗体组、IgG组和ALDO+HMGB1抗体组ROS水平显著降低（P＜0.05），Rosup组ROS水平升高（P＜0.05）；与HMGB1抗体组比较，ALDO+HMGB1抗体组和Rosup组ROS水平升高（P＜0.05）；与IgG组比较，ALDO+HMGB1抗体组和Rosup组ROS水平升高（P＜0.05）；与Rosup组比较，ALDO+HMGB1抗体组ROS水平降低（P＜0.05）；Control组、HMGB1抗体组和IgG组组间两两比较差异无统计学意义。即ROS水平：Rosup组＞ALDO组＞ALDO+HMGB1抗体组＞HMGB1抗体组/Control组/IgG组，见表1、图1。

Tab.1 Effects of different intervention conditions on ROS levels in NRK-52E cells表1 各组不同干预条件对NRK-52E细胞内ROS水平的影响 （x±s）

Fig.1 Effects of different intervention conditions on ROS level in NRK-52E cells图1 各组不同干预条件对NRK-52E细胞内ROS水平的影响

2.2 ALDO对NRK-52E细胞IL-1β蛋白表达的影响 由表2析因方差分析结果可得，PALDO＜0.05，即ALDO可上调IL-1β蛋白的表达；PNAC＞0.05，即NAC对 IL-1β 蛋白的表达无影响；PALDO×NAC＜0.05，即ALDO与NAC两因素间存在交互作用，且对IL-1β蛋白表达有抑制作用，见表2、图2。

Tab.2 Effects of aldosterone on the expression of IL-1β in NRK-52E cells表2ALDO对NRK-52E细胞IL-1β蛋白表达的影响（n=3，x±s）

Fig.2 Effects of aldosterone on the expression of IL-1β protein in NRK-52E cells图2 ALDO对NRK-52E细胞IL-1β表达的影响

2.3 ALDO对NRK-52E细胞HMGB1蛋白表达的影响 与Control组（0.33±0.13）比较，ALDO组（0.56±0.05）HMGB1蛋白的表达上调（n=3，t=2.841，P＜0.05），见图3。

Fig.3 Effects of aldosterone on HMGB1 protein expression in NRK-52E cells图3ALDO对NRK-52E细胞HMGB1表达的影响

2.4 阻断HMGB1改善ALDO诱导的NRK-52E细胞自噬 Western blot结果显示，与Control组比较，ALDO组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达上调，p62蛋白表达下调（P＜0.05）。与ALDO组比较，ALDO+HMGB1抗体组LC3-Ⅱ蛋白表达降低、p62蛋白表达增加（P＜0.05），Beclin-1蛋白的表达差异无统计学意义。与HMGB1组相比，ALDO+HMGB1抗体组Beclin-1蛋白的表达增加（P＜0.05）。在Control组、HMGB1抗体组、ALDO+HMGB1抗体组间LC3-Ⅱ、p62蛋白表达差异无统计学意义；Control组、HMGB1抗体组间Beclin-1蛋白表达差异无统计学意义，见表3、图4。

Tab.3 Effects of HMGB1 blocking on ALDO-induced autophagy of NRK-52E cells表3 阻断HMGB1对ALDO诱导NRK-52E细胞自噬的影响 （n=3，x±s）

Fig.4 Effects of HMGB1 blocking on ALDO-induced autophagy of NRK-52E cells图4 阻断HMGB1对ALDO诱导NRK-52E细胞自噬的影响

3 讨论

慢性肾脏病是当代全球危害人类健康的重大疾病，其发病机制十分复杂。近年来研究发现，ALDO是CKD进展的一个关键递质，可独立于肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）直接参与肾小管损伤和肾间质纤维化的过程［4］。ALDO促发的炎症反应与线粒体功能障碍所致的细胞内ROS产生过量有关，但其确切机制尚未阐明［5-7］。在骨骼肌缺血/再灌注损伤研究中发现，ALDO可诱导HMGB1分泌增加，激活TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，致使远隔心肌组织损伤［8］。Abdulmahdi等［9］在脓毒症致人肾近端小管（HK-2）细胞损伤模型中发现氧化应激参与了HMGB1的释放。对于HMGB1在ALDO诱导肾小管上皮细胞自噬中的作用尚鲜见报道。本研究发现，10 nmol/L ALDO处理NRK-52E细胞24 h后，细胞内ROS的水平较Control组明显升高；ALDO+HMGB1抗体组细胞内ROS的水平较ALDO组明显降低，上述结果提示HMGB1参与了ALDO促发的炎症反应过程。

HMGB1是一种高度保守的核蛋白，可以通过主动分泌和被动释放两种方式进入胞外，除了在免疫和炎性过程中发挥作用外，还可作为调节因子影响细胞自噬［10］。胞浆内的HMGB1与自噬相关蛋白Beclin-1结合，激活自噬。自噬发生时，胞浆中的LC3-Ⅰ发生断裂，与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ并定位在自噬小体膜上；而泛素结合蛋白p62则可直接偶联在LC3上，参与自噬体的构成［11］。有研究报道，HMGB1可诱导心肌细胞自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白的表达上调，而抑制HMGB1后上述蛋白表达明显降低［12］。而本研究中，10 nmol/L ALDO刺激NRK-52E细胞后，HMGB1和IL-1β蛋白的表达均较Control组增加，同时细胞自噬也增加（Beclin-1和LC3-Ⅱ的表达上调，p62的表达下调）。经50µmol/L NAC预处理NRK-52E细胞后，IL-1β蛋白的表达较ALDO组明显下调；而给予1 mg/L HMGB1抗体预处理后，LC3-Ⅱ蛋白的表达较ALDO组明显降低、p62蛋白的表达较ALDO组明显增加。上述研究结果表明，HMGB1可能是通过刺激IL-1β的释放，加重氧化应激和炎症反应，进而诱导肾小管上皮细胞自噬，以维持细胞的稳态和完整性。

综上所述，ALDO可能通过促进肾小管上皮细胞内ROS的产生，增加HMGB1分泌，刺激炎症因子IL-1β的释放，进而诱导自噬的发生；抑制HMGB1的释放可逆转这一现象。HMGB1可能作为ALDO诱导肾小管上皮细胞损伤的新靶点，在慢性肾脏病的治疗中发挥重要作用，后期将深入研究其具体的分子机制。