一株鸡源宋内氏志贺氏菌的分离鉴定与耐药性分析

代永联，郝小静，衣服德，檀学进，冯永胜

(青岛市畜牧兽医研究所，山东 青岛 266100)

志贺氏菌是一种能引起人和动物腹泻的革兰氏阴性杆菌。根据抗原结构，其可分为痢疾志贺氏菌(Shigella dyseteriae)、福氏志贺氏菌(Sh.flexneri)、鲍氏志贺氏菌(Sh.boydii)和宋内氏志贺氏菌(Sh.sonnei)四个种群[1]。2019年9月，我们从青岛某规模化鸡场的病鸡肝脏中分离到了一株疑似志贺氏菌的病原菌(编号为LB2-1)，通过分离培养、生化反应以及16S rDNA测序，最终确定该菌株为宋内氏志贺氏菌。药敏试验发现，该菌株对多种抗生素有不同程度的耐药性，但对左氧氟沙星和丁胺卡那最为敏感，对新霉素和盐酸多西环素的敏感性次之，这一结果可供当地鸡场在防治畜禽宋内氏志贺氏菌病时提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

NA培养基、SS琼脂培养基、麦康凯培养基、营养肉汤培养基、志贺氏菌显色培养基、三糖铁培养基和志贺氏菌成套生化鉴定管等均购于青岛海博生物技术有限公司。

1.2 主要仪器设备

SW-CJ-1FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，SHP-250型智能生化培养箱(上海三发科学仪器有限公司)，ZHWY-100B型恒温培养摇床箱(上海一恒科学仪器有限公司)，BX53生物显微镜(日本奥林巴斯医疗株式会社)，Research plus 可调量程移液器(Eppendorf 公司)。

1.3 方法

1.3.1 细菌的分离纯化

在无菌状态下，从病鸡的肝脏内部取少量病料，分别划线接种于SS琼脂培养基和麦康凯培养基上，并置于37℃恒温培养箱中培养18 h～24 h，观察菌落生长状况与形态；挑选典型菌落接种于含5 mL营养肉汤培养基的试管中，置于37℃恒温摇床(转速为170 r/min，下同)中培养18 h～24 h；从营养肉汤培养基中取适量菌液，划线接种于NA 琼脂上，然后将其置于37 ℃恒温培养箱中，纯化培养18 h～24 h；按照以上方法重复纯化3～5次，直至获得纯的菌落，随后挑选典型菌落进行革兰氏染色，再用显微镜检查，观察细菌形态。

1.3.2 细菌的显色培养

用接种环取一环菌液，接种于志贺氏显色培养基上，将接种好的培养基置于37 ℃恒温培养箱中培养18 h～24 h。

1.3.3 细菌的生化试验

挑选志贺氏显色培养基上的典型菌落，随后分别接种于三糖铁琼脂和志贺氏菌成套生化鉴定管进行测定，详细观察并记录结果。

1.3.4 16S rDNA 测序分析

对数期的菌样由上海派森诺基因科技有限公司进行检测。

1.3.5 药敏试验

选取氨苄西林钠、复方新诺明、链霉素、庆大霉素、头孢曲松钠、氟苯尼考、新霉素、左氧氟沙星、丁胺卡那和盐酸多西环素等10种药敏试纸片，按照世界卫生组织推荐的Kirby-Bauer法进行耐药试验[2]，并按照美国临床实验室标准委员会标准进行判断。

2 结果

2.1 菌落形态与革兰氏染色特性

细菌在SS琼脂培养基上形成整体半透明、边缘整齐、表面光滑、稍微凸起和湿润圆形的菌落；在NA 琼脂上形成直径为3 mm左右有白色凸起且表面光滑且湿润圆形的菌落；在麦康凯培养基上形成无色透明、光滑且凸起的圆形菌落。经革兰氏染色镜检，该菌为红色且两端钝圆的短杆状阴性菌。

2.2 显色培养结果

致病菌LB2-1在志贺氏显色培养基上呈直径为1 mm～3 mm的圆形、边缘整齐、表面光滑、稍微凸起以及带蓝色中心的白色菌落。

2.3 生化检验结果

三糖铁琼脂反应结果显示：底层产酸但未产气，斜面颜色未变，未产生H2S；经过志贺氏菌成套生化鉴定管测定，参照志贺氏菌生化鉴定GB 4789.5-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验》标准判定，详细结果见表1。

2.4 16S rDNA测序分析结果

送上海派森诺基因科技有限公司进行16S rDNA 测序，美国国家生物技术信息中心官网上利用BLAST 与GenBank 数据库中的数据进行比对分析，结果表明LB2-1 菌株与宋内氏志贺氏菌(Sh.sonnei)的进化距离较近且同源性高，相似度为99.72%。

2.5 耐药试验检测结果，

LB2-1 菌株对10种常用抗生素的耐药分析结果见表2。

由表2 可知，LB2-1 菌株对氨苄西林、复方新诺明、链霉素和氟苯尼考等均产生了不同程度的耐药性，对左氧氟沙星和丁胺卡那有良好的敏感性。

3 讨论

在中国，最常见的志贺氏菌是痢疾志贺氏菌和福氏志贺氏菌，宋内氏志贺氏菌比较少见，但随着人员的流动和动物品种的引进，我国畜禽养殖行业动物感染宋内氏志贺氏菌的比例呈明显的上升趋势[2]。根据本试验对病原菌LB2-1 菌株的分离与鉴定，最终确定其为宋内氏志贺氏菌，说明本地区其他畜禽养殖场也存在动物感染宋内氏志贺氏菌的风险，因此本地区畜禽养殖场需要加强动物感染宋内氏志贺氏菌的防治工作。

近年来，随着抗生素的大量使用，许多细菌对各种抗生素产生了不同程度的多重耐药性，志贺氏菌的耐药范围和耐药水平也在不断攀升[3]。本次药敏试验发现，LB2-1 菌株已经对氨苄西林、复方新诺明和链霉素等多数抗生素产生了耐药性，因此在进行临床治疗时，兽医要注意筛选敏感抗生素，做到精准用药；同时，在几种敏感抗生素中，应采用轮换用药，避免细菌产生耐药性。另外，近年来有些科研单位和兽药生产厂研制的新型微生态制剂(如噬菌体)、裂解酶和中草药等来替代抗生素，也成为解决畜禽细菌性疾病防治的一种新途径。