B淋巴细胞表型在激素依赖及频繁复发肾病综合征患儿的临床意义

于跑 彭倩倩 董晨 陈娜 张远 关凤军

1 徐州医科大学附属医院儿科（江苏徐州221002）；2徐州医科大学附属儿童医院儿肾科（江苏徐州221002）

近年发现，激素依赖及频繁复发肾病综合征（steroid-dependent nephrotic syndrome/frequent relapse nephrotic syndrome，SDNS/FRNS）患儿有增加趋势［1］。虽然临床上在糖皮质激素（glucocorticoid，GC）的基础上加用了环磷酰胺等免疫抑制剂治疗，但仍存在相当一部分复发病例。儿童原发性肾病综合征（primary nephrotic syndrome，PNS）的发病机制迄今尚不明确。以往该病主要考虑与T 淋巴细胞功能紊乱有关［2］。而CD20 单克隆抗体（rituximab，RTX）治疗这部分患儿有效提示了B 淋巴细胞可能参与了发病［3］。以往研究发现，PNS 外周血传统B 淋巴细胞亚群分型显示，CD19、CD20的表达在不同GC 反应的患儿中无显著性差异［4］。然而，B 淋巴细胞是由具有表型和功能的不同亚群组成的异质性群体，不同B 淋巴细胞表型可能发挥着不同的作用。因此，探讨B 淋巴细胞在PNS患儿免疫活化状态中的作用，需进行深入精细分型研究。本研究通过流式细胞术测定SDNS/FRNS患儿B 淋巴细胞表型的分布情况，为评估SDNS/FRNS 患儿免疫功能状态、疾病活动预测提供重要的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年4月至2019年4月于徐州医科大学附属医院诊断为原发初治SDNS 患儿110例，门诊随访1年，所有患儿均按照诱导缓解及巩固治疗2 个阶段治疗，按照患儿对GC 的疗效及复发频次，剔除13例未复发肾病综合征患儿，其中50例SDNS/FRNS 患儿为研究组，男26例，女24例，年龄2.5～13（7.2 ± 3.8）岁；47例非频繁复发肾病综合征患儿为对照组，男25例，女22例，年龄2.5～14（7.3±3.8）岁。诊断符合中华医学会发布的《儿童激素敏感、复发/依赖肾病综合征诊治指南（2016年）》的标准［5］。排除了感染、免疫性疾病、内分泌疾病及恶性肿瘤等继发性因素。两组的性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。所有研究对象签署知情同意书，本研究经徐州医科大学附属医院伦理委员会审批通过。

1.2 治疗方法所有患儿初次发病时均给予醋酸泼尼松片（江苏恒瑞制药有限公司，国药准字H41020636）2 mg/（kg·d），分3 次口服治疗，正规减量。缓解期以临床症状消失，蛋白尿转阴为标准。所有病例均在蛋白尿转阴后1 周内复测各项指标。

1.3 主要试剂和仪器藻青蛋白（allophycocyanin，APC）标记的抗人CD19 抗体、异硫氰荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的抗人CD27 单克隆抗体、藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的抗人CD24 单克隆抗体、多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyⅡprotein，Percp-cy5.5）抗人CD38 抗体、FITC 标记的抗人CD3 单克隆抗体/PE 标记的抗人CD（16+56）单克隆抗体，均购自Biolegend 公司。血细胞计数仪（Sysmex xs-800i），LSRFortessaTM型流式细胞仪（美国BD Biosciences 公司），FACSDvia 流式细胞分析软件（美国BD Biosciences 公司）。

1.4 方法B 细胞及NK 细胞检测：分别于初治前及缓解后抽取患儿清晨空腹1mL EDTA 抗凝静脉血，其中0.5 mL 用血细胞计数仪测得总淋巴细胞绝对数；取100 μL EDTA 抗凝血，分别加入FITCCD3、APC-CD19 和PE-CD（16+56）抗体，室温避光培养30 min 后，加2 mL 溶血素溶解红细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）洗2 次后，流式细胞术分析B 淋巴细胞和NK 细胞的百分数，然后根据总淋巴细胞数量，计算B 淋巴细胞及NK 细胞绝对数。B 细胞精细免疫分型检测：取两根流式管，分别标记为B-1、B-2，B-1 为同型对照组，B-2 为待检测组；B-1 管加入抗APC，FITC、PE 和Percp-cy5.5 标记的同型抗体；B-2 管加入抗CD19（APC）、抗CD27（FITC）、抗CD24（PE）和抗CD38（Percp-cy5.5）抗体；向B-1、B-2 管中各加入混匀的50 μL 待测样品，混匀后室温避光孵育30 min；用自配的红细胞裂解液，37 ℃水溶约10 min，待完全溶血后，PBS 洗1 次后，流式细胞术分析得出各类B 细胞亚群的相对数（百分数），该相对数为相对于B 细胞数目的百分数；根据B 淋巴细胞的绝对数和各B 细胞亚群的相对数（百分数），计算获得各B 细胞亚群的绝对数。

1.5 统计学方法应用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，对收集的组别资料分别进行KS 检验，以判断所收集数据是否符合正态分布及方差齐，若符合条件两样本均数比较采用独立样本t检验，不符合采用Mann-WhitneyU检验，同组治疗前后比较采用配对t检验，相关两组数据间用Pearson 相关及Spearman 等级分析法分析数据间的相关性，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组B 淋巴细胞亚群及NK 细胞绝对数的表达情况比较活动期：SDNS/FRNS 组患儿总CD19＋B 细胞、记忆B 细胞和过渡型B 细胞的绝对数较对照组升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；初始B 细胞及浆母细胞绝对数较对照组有降低趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；NK 细胞较对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1～3。缓解期：两组总CD19＋B细胞、记忆B细胞、过渡型B 细胞、初始B 细胞、浆细胞的绝对数相比，差异均无统计学意义（P＞0.05），NK细胞绝对数较对照组上升，但差异无统计学意义（P＞0.05）；两组总CD19＋B 细胞、记忆B 细胞和过渡型B 细胞的绝对数较活动期均下降，差异有统计学意义（P＜0.05），但SDNS/FRNS 组下降明显；初始B 细胞、浆细胞绝对数较活动期差异无统计学意义（P＞0.05）；两组NK 细胞绝对数较活动期均上升，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图1 SDNS/FRNS 患儿在GC 治疗前B 淋巴细胞亚群百分比Fig.1 Percentage of B lymphocytes subsets in children with SDNS/FRNS before GC treatment

图2 SDNS/FRNS 患儿在GC 治疗后B 淋巴细胞亚群百分比Fig.2 Percentage of B lymphocytes subsets in children with SDNS/FRNS after GC treatment

2.2 SDNS/FRNS 组患儿NK 细胞绝对数与CD19+B 淋巴细胞及其亚群的相关性分析SDNS/FRNS组患儿NK细胞绝对数与CD19+B 细胞（r=-0.554，P＜0.001）、过渡型B 细胞（r=-0.610，P＜0.001）、记忆B 细胞绝对数（r=-0.617，P＜0.001）呈明显负相关；与初始B 细胞（r= 0.022，P= 0.878）和浆母细胞（r=-0.151，P= 0.296）绝对数均未提示有相关性（图4）。

3 讨论

近年来研究发现B 淋巴细胞功能紊乱在PNS的发病中起着非常重要的作用［6］。特别是应用B 细胞耗竭剂（利妥昔单抗RTX）成功治疗一些难治性NS 病例的报道［7］。RTX 以CD20 分子为靶点，能与细胞表面CD20 分子以高亲和力结合，从而清除被结合的B 淋巴细胞，使体内B 淋巴细胞数量显著减少。国外研究显示,大多数自身抗体在耗尽后，其临床反应仍然存在［8］，这表明B 细胞可能以一种与抗体无关的方式导致组织损伤。外周血B 细胞按照发育阶段及功能的不同，分为初始B、过渡型B、记忆B 及浆母4 群细胞，每群细胞具有不同的特征和功能，而CD20 表达于除祖B 细胞及浆母细胞外的前B 细胞至成熟B 细胞各阶段的B细胞上［9］，因此表达CD20 分子的各个阶段B 细胞理论上均为RTX 治疗的靶细胞。然而国外学者发现，应用CD20 单抗治疗SDNS/FRNS 患儿后，复发率仅有一定程度的减低，提示不同患儿可能存在各阶段B 细胞表达的差异，从而临床上呈现出不同的RTX疗效，然而目前缺乏总体水平的监测与分析［10］。

图3 各组患儿CD19+总B 淋巴细胞及其亚群绝对数的统计Fig.3 Statistical map of the absolute number of subpopulations of CD19+total B lymphocytes in each group

图4 NK 细胞绝对数与CD19+B、过渡型B 及记忆B 淋巴细胞绝对数的相关性分析Fig.4 Correlation between absolute number of NK cells and absolute number of CD19+B，transitional B and memory B lymphocytes

本研究通过荧光标记CD19、CD24、CD27 以及CD38 这4 种分子的不同组合，将过渡型B 细胞、初始B 细胞、记忆B 细胞以及浆母细胞4 个表型从B淋巴细胞中分选出来。既往研究发现，PNS 患儿外周血CD19+B 细胞数明显高于正常儿童，同时在复发性NS 患儿中也发现，CD19+B 细胞数均显著高于对照组，而在缓解的SDNS 患儿中B 细胞总量降低［11］。本研究显示，两组患儿发病初始CD19+B细胞绝对数升高，但SDNS/FRNS 组较对照组升高显著，而经过GC 治疗缓解后降低，与文献报道一致，提示两组患儿存在B 淋巴细胞异常活化与扩增的亢进，并且可能和患者疾病类型及活动程度有一定关系。考虑可能与疾病活动时B 淋巴细胞过度增殖、凋亡减少有关［12］。而KEMPER 等［13］在临床观察到未治疗的SDNS 无论在复发活动期或缓解期CD19+B 细胞数均降低，其原因可能由于免疫抑制治疗的差异，免疫抑制治疗可以直接或间接地影响B 淋巴细胞的稳态和功能所致。

国外近期研究PNS 发作时总B 细胞水平的增加，过渡型和记忆B 细胞的水平明显增加，在复发期间，总记忆B 细胞数显著高于正常对照组，在缓解期，总记忆B 细胞数显著减少［11］。另一项应用利妥昔单抗治疗FRNS 患者的研究［14］提出，记忆B细胞的恢复可以预测复发的风险，提示记忆细胞的增高参与SDNS的发病。而本研究发现两组过渡型B细胞、总记忆B细胞活动期均上升，但SDNS/FRNS组升高更明显，提示不同发育阶段的B 淋巴细胞异常程度跟疾病活动有关。过渡型B 细胞是B 细胞活化阶段的关键时期，此阶段细胞如果没有受到抗原刺激转换成记忆B 细胞则面临凋亡，过度增加提示可能存在清除障碍或者功能障碍，因此，我们在研究中进一步检测了NK 细胞的绝对计数，发现经过GC 治疗后两组NK 细胞绝对数都有所下降，此结果与周晖登等［15］的研究结果一致。同时我们通过相关性分析，发现SDNS/FRNS 组活动期外周血NK 细胞绝对数与CD19+B 细胞、过渡型B细胞、记忆B 细胞绝对数均呈负相关关系。由于NK 细胞是体内非特异性免疫效应细胞，对多种细胞如T、B 淋巴细胞具有调节作用［16］，因此笔者推测在SDNS/FRNS 患儿中存在NK 细胞功能障碍，进而影响了过渡型B、记忆B 淋巴细胞的清除。而NK 细胞绝对计数的减少，则减弱了对T、B 淋巴细胞免疫调节作用，从而使B 淋巴细胞及其各亚群也出现功能紊乱及数量变化，从而产生临床症状及体征以及实验室检查的变化。

目前对过渡型B 细胞的活动规律还不完全清楚，在儿童SDNS/FRNS 发病机制中的具体作用尚未完全阐明［17］。而记忆B 细胞作为最特殊的抗原特异性B 细胞，在生存、激活、增殖、免疫球蛋白分泌和抗原表达等方面的基因表达增加，使它们成为免疫应答的高效激活者［18］，在SDNS/FRNS 发病时增多可能与抗原刺激其大量增殖有关，但如何被异常激活，有关清除以及功能障碍的研究值得未来进一步探索。

综上，B 淋巴细胞亚群在SDNS/FRNS 患儿体内存在分布异常，其异常的程度可提示疾病类型，尤其过渡型B 细胞、记忆B 细胞绝对数显著增多往往提示患儿激素依赖或者频繁复发；同时也为SDNS/FRNS 患儿新的治疗靶点提供了理论依据。NK 细胞与SDNS/FRNS 患儿的过渡型B 细胞、记忆B 细胞的清除障碍密切相关。