人肌源性干细胞的生物特性及其治疗假肥大肌营养不良症模型鼠的初步研究

张惠丽 成秋生 陈希 李泽

肌源性干细胞（muscle-derived stem cells，MDSCs）是指从骨骼肌组织中分离出来的具有自我更新和多向分化潜能的细胞［1］。预贴壁法［2］是近十年来广泛运用的培养方法。但是，研究者［3-6］对细胞群的贴壁时间存在分歧，且作者都只提到贴壁4 ～5 d，而笔者的研究小组前期发现，同样的操作方法及相同的试剂仪器，却可以从正常人的腓肠肌组织中分离出贴壁6、7、8 d 的细胞群。为进一步判断贴壁时间更长的肌源性细胞是否还是属于MDSCs，笔者重点比较贴壁6 d（D6-hMDCs）和贴壁8 d（D8-hMDCs）的慢贴壁细胞群与贴壁1 d的快贴壁细胞群（D1-hMDCs）的不同，这对阐明人的肌源性干细胞的生物特性具有重要的意义，能为细胞移植治疗假肥大肌营养不良症扩大细胞来源提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物纯合子mdx 配种鼠（C57BL/10Sc-Sn-DMDmdx）和正常C57BL/6 鼠。

1.2 主要试剂骨骼肌增殖培养基（Stem cell，加拿大）、TRIzol 试剂（Invitrogen，美国）、SYBR®PrimeScript®RT-PCR 试剂盒（Takara，日本）。

1.3 实验方法

1.3.1 组织取材经知情同意，取腓骨骨折患者的腓肠肌组织约5 g。

1.3.2 hMDCs 的分离及培养参照预贴壁法［2］分离细胞，首次铺板2 h 后，将未贴壁细胞移入新培养瓶（2 h 内贴壁的绝大部分是成纤维细胞），24 h后再次将未贴壁细胞移入新培养瓶，如此反复，直至分离出贴壁6 d 的“D6-hMDCs”和贴壁8 d 的“D8-hMDCs”。

1.3.3 免疫表型鉴定hMDCs 加入FITC 荧光标记的小鼠抗人源CD117、CD184、CD45、CD114、CD56、CD146、CD34、CD44、CD73 和CD90，流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。

1.3.4 免疫荧光检测制作细胞爬片，4%多聚甲醛固定15 min，0.3%TritonX-100 破膜15 min，加入一抗desmin（1∶200，Abcom），Pax7（1∶150，Abcom）和MHC（1∶200，DSHB），4 ℃过夜，加入荧光标记的二抗（1∶1 000，CST），室温避光孵育1 h，DAPI 核染色，荧光显微镜下观察拍照。

1.3.5 Real-time PCR 检测成肌标记收集细胞，提取RNA 后反转为cDNA，PCR 检测相关细胞因子。GAPDH 为内参基因。

1.3.6 Western Blotting 检测成肌标记收集细胞，按Western Blotting 法检测相关蛋白desmin（1∶7 000，Abcom），MHC（1∶500，DSHB）和Pax7（1∶500，Abcom），GAPDH（1∶8 000，CST）为内参。

1.3.7 移植后mdx 鼠腓肠肌组织dystrophin 免疫荧光检测将hMDCs 注射到mdx 鼠左侧腓肠肌（每只30 μL），PBS 注射右侧作为对照，2 周后取材。制成8 μm 冰冻切片，行dystrophin 染色，一抗DYS（1∶20，Abcom），具体方法参照1.3.4。

1.4 统计学方法应用SPSS 19.0 进行分析。数值以均数±标准差表示。组间比较用方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫表型鉴定D6-hMDCs 和D8-hMDCs 表面标记物表达几乎一致。其中CD56、CD45 和CD184均呈显著高表达（与D1-hMDCs 相比，P＜0.05）。

2.2 细胞免疫荧光显示不同hMDCs 间的成肌能力有差别在增殖培养基（growth medium，GM）下，三者hMDCs 的Pax7 及desmin 表达无差异；D6-hMDCs 和D8-hMDCs 的MHC 表达均显著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），但D6-hMDCs 和D8-hMDCs间没有差异（图1A）；经分化培养基（differential medium，DM）诱导15 d 后，三者hMDCs 的Pax7 表达无差异；D6-hMDCs 和D8-hMDCs 的desmin 及MHC表达均显著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），但D6-hMDCs和D8-hMDCs间没有差异（图1B）。

图1 细胞免疫荧光检测成肌标志物的表达Fig.1 The expression of myogenetic marks in hMDCs by IF

2.3 Real-time PCR显示不同hMDCs间的成肌能力有差别在GM下，MyoD1、myogenin、Myf5、α7-integrin和M-cadherin 的mRNA 表 达 在D6-hMDCs 和D8-hMDCs 上均显著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），但D6-hMDCs 和D8-hMDCs 间没有差别（图2A）。

经DM 分化4 d，MyoD1、Myogenin、desmin 和MHC 的mRNA 表达在D6-hMDCs 和D8-hMDCs 上均显著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），但D6-hMDCs 和D8-hMDCs 间没有差别（图2B）。

2.4 Western Blotting显示不同hMDCs间的成肌能力有差别在GM 下，MHC 蛋白水平在D6-hMDCs和D8-hMDCs 均显著高于D1-hMDCs（均P＜0.05），且在D8-hMDCs 显著高于D6-hMDCs（P＜0.05，图3A）。

经DM 分化7 d，desmin 和MHC 的蛋白水平在D6-hMDCs 和D8-hMDCs 均显著高于D1-hMDCs，但在D8-hMDCs 与D6-hMDCs 间没有差异（图3B）。

图2 不同细胞因子mRNA 相对表达水平Fig.2 Relative mRNA expression levels of different cytokines

2.5 移植不同hMDCs 后，dystrophin 蛋白表达有差异D6-hMDCs 组 和D8-hMDCs 组dystrophin 阳性率显著高于D1-hMDCs 组（均P＜0.05），但D6-hMDCs 组和D8-hMDCs 组间没有差异（图4）。

3 讨论

MDSCs 作为治疗假肥大肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）明显有效的干细胞来源之一［7］，从发现之初，就备受关注。目前研究者对MDSCs 培养所需的贴壁时间存在争议，且最长贴壁时间为4～5 d［3-4］。而本研究发现贴壁6 d（D6-hMDCs）和8 d（D8-hMDCs）的慢贴壁细胞群，贴壁时间不一致，考虑与研究物种［8-9］、操作［5］、使用的器皿和试剂等［10］相关。

D6-hMDCs 和D8-hMDCs 的流式标记物表达几乎一致，提示两者可能属同一细胞群。MDSCs 呈CD56［11］、CXCR4［12］阳性，但CD45 阴性［13］。本研究发 现CD56 及CXCR4 在D6-hMDCs 和D8-hMDCs 呈高表达，提示两者可能为MDSCs，但呈CD45（+），考虑与培养方法不尽相同［14］及标记物随着体外增殖分化而改变［15］有关。

图3 成肌标记物的表达水平Fig.3 Relative protein expression levels of myogenic markers

图4 hMDCs 移植mdx 鼠后腓肠肌组织dystrophin 蛋白表达Fig.4 The dystrophin expression of gastrocnemius in mdx transplanted by hMDCs

无 论 是GM 还 是DM 培 养 下，D6-hMDCs 和D8-hMDCs 均比D1-hMDCs 表现出高表达成肌标志物demsin［16］和MHC，这与文献［3-4］报道的慢贴壁细胞群比快贴壁细胞群具有更强成肌能力相一致。

MyoD1、myogenin 和Myf5 是成肌诱导因子，在GM 下（未诱导分化条件下）出现表达水平上调，支持D6-hMDCs 和D8-hMDCs 更易于成肌分化。此外D6-hMDCs 和D8-hMDCs 高表达α7-integrin，且移植mdx 鼠后呈现更多dystrophin 阳性肌细胞，与文献［17］报道α7-integrin 阳性的成肌祖细胞具有更强的再生潜能相符。D6-hMDCs 和D8-hMDCs 同样表达高M-cadherin 等肌卫星标记，提示MDSCs 和肌卫星细胞的表面标记物存在部分重叠。

Pax7 被认为是经典的静息期和增殖期的肌卫星细胞的标记［18］，本研究中在GM 和在DM 下，三者hMDCs 均完全表达pax7，推测pax7 不仅是肌卫星细胞的标记，还可能是肌源性干细胞的标记。

移 植D6-hMDCs 和D8-hMDCs 的mdx 鼠腓肠肌出现的dystrophin 阳性肌纤维数较D1-hMDCs 明显增多，但两者间没有差异，说明慢（晚）贴壁细胞群D6-hMDCs 和D8-hMDCs 比快贴壁细胞群D1-hMDCs 具有更强的肌肉再生能力。Dystrophin 阳性肌纤维表达量比CAO 等［4］报道表达量要低，但与CHIRIELEISON 等报道相似，考虑与供体细胞来源的种属不同相关，间接说明人源MDSCs 与鼠源MDSCs 的生物特性有明显不同。

总之，利用预贴壁法，从正常人腓肠肌组织中能分离出更慢贴壁的细胞群。慢贴壁的细胞群D6-hMDCs 和D8-hMDCs 具有相似的生物学特性，相比于D1-hMDCs，两者具有更强的成肌分化能力，且移植mdx 鼠后能再生出更多dystrophin 阳性的肌纤维。