益气活血方对心力衰竭大鼠心功能的影响及其机制

邢俊娥，吴鹏，李海沅，张兴博

广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023

慢性心力衰竭(CHF)又称充血性心力衰竭(简称心衰)，是一种中老年人常见而又复杂的临床症状群，是各种心血管疾病发展的共同终末阶段，病死率极高。近年来，CHF的治疗已经取得很大的进展，特别是随着血管紧张素转换酶抑制剂、β受体阻滞剂及冠状动脉血管重建术的应用，心衰患者的生存时间明显延长，病死率显著下降。然而因人口老龄化程度的日益加深，CHF的发病率逐年增加，每年CHF死亡人数并没有减少，甚至还存在上升趋势[1]。因此，积极探讨CHF的发病机制和开发有效防治CHF的药物仍是当今心血管疾病领域重大课题之一。Wnt/β-catenin信号通路是广泛存在于多细胞真核生物中的一条高度保守的信号传导通路，参与调控细胞的增殖、凋亡、迁移、分化等多种生理病理过程。近年来研究发现，Wnt/β-catenin信号通路异常激活可使细胞及生物体的功能产生障碍或损坏，比如导致心肌细胞肥大、心肌纤维化[2]，通过干预此信号通路蛋白的表达可诱导多能干细胞向心肌细胞分化，从而提高心功能、改善心衰症状[3,4]。这使人们逐渐认识到Wnt/β-catenin信号通路异常激活可能是心衰发生发展中的重要因素。益气活血方以补心益气、活血利水为法立方，前期研究表明其能减少心肌组织细胞凋亡发挥抗心衰的作用[5]。2018年5月～2019年5月，本研究通过观察益气活血方对心衰大鼠心肌细胞Wnt/β-catenin信号通路表达的影响，探讨益气活血方治疗心衰的可能机制，为其在临床上的应用提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 益气活血方由广西中医药大学第一附属医院中药房提供，药物组成：黄芪20 g、党参30 g、赤芍15 g、川芎15 g、丹参15 g、麦冬10 g、五味子15 g、茯神15 g、炙甘草8 g，制成每毫升含生药1.52 g的溶液。氯沙坦片(杭州默沙东制药有限公司，批号：H20000371，规格：50 mg/片)；兔抗大鼠Dvl1抗体(Sigma-Aldrich公司)；兔抗大鼠p-GSK-3β(Ser9)抗体(Cell Signaling公司)；兔抗大鼠B-catenin抗体(Epitomics公司)。

1.1.2 动物 健康雄性SD大鼠120只，体质量(200±20)g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物许可证编号:SYXK(桂)2013-0005。

1.1.3 仪器 JA203型精密电子天平(上海海康电子仪器厂)；TKR小动物呼吸机(江苏特力麻醉呼吸公司)；ML870Br心电图机(澳大利亚埃德公司)；MICRO MAXX型彩色多普勒超声诊断仪(美国索诺声公司)；Anke TGL-16B离心机(上海安亭科学仪器厂)；蛋白质电泳与转膜装置(美国Bio-Rad公司)。

1.2 CHF模型制作 将120只大鼠适应性喂养1周后随机分为造模组100只与假手术组20只。以10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉，将其固定于手术台，经喉行气管插管术，连接小动物呼吸机及心电图机，以呼吸频率80次/min、潮气量0.7～0.8 mL(按体质量调节)行人工辅助呼吸。左胸前区备皮去毛，络合碘消毒，在左侧第3、4肋间隙横向切开皮肤，长约1.5 cm，钝性分离肌层，沿第3、4肋间隙打开胸腔并用开胸器撑开，撕开心包，在动脉圆锥与左心耳之间下约1 mm处用0号丝线结扎左冠状动脉前降支，当心电图Ⅰ、Ⅱ导联显示ST段显著抬高后，迅速将心脏放回胸腔，挤出胸腔内血液和气体，并立即分层缝合胸壁，开胸时间不超过30 s。待动物状态平稳后，停止呼吸机辅助呼吸。术后连续3 d腹腔注射青霉素[2.4×104U/(kg·d)]预防感染。假手术组手术过程同上，但仅在冠状动脉前降支下穿线不结扎。然后将存活大鼠返笼继续常规饲养4周，4周后心脏彩色超声检测左室射血分数<50%者为CHF模型复制成功。

1.3 动物分组与给药 将CHF大鼠随机分成4组：模型组、益气活血方低剂量组、益气活血方高剂量组和氯沙坦阳性对照组，每组10只，益气活血方低、高剂量组及氯沙坦阳性对照组分别灌胃3.04、6.08 g/(kg·d)益气活血方及10 g/(kg·d)氯沙坦；另选择假手术组10只，假手术组及模型组以20 mL/kg蒸馏水灌胃，益气活血方低剂量组、益气活血方高剂量组和氯沙坦阳性对照组将药物溶于等体积蒸馏水中，1次/d，疗程4周。

1.4 心功能测定 药物干预4周后，利用心脏彩色多普勒超声诊断仪检测心功能。具体方法如下：大鼠称重，以1%戊巴比妥钠(0.03 g/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，心前区脱毛，涂抹耦合剂，用心脏超声探头(频率为6～13 MHz)，在二维超声引导下，运用M型超声经胸骨左心长轴切面测量如下指标：左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD)，计算左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)。心脏超声测定后以颈椎脱臼法处死小鼠，并快速采集心肌组织标本，置入-80 ℃冻存待测。

1.5 心肌组织Dvl1、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)和β-连环蛋白(β-catenin)表达检测 切取-80 ℃保存心肌组织200 mg，匀浆，12 000 r/min离心15 min后取上清液进行蛋白测定。SDS-PAGE凝胶电泳，取1 μg蛋白变性后冷却，加样，电泳，转膜；转膜后加封闭液，室温封闭2 h，加入兔抗Dvl1抗体(1∶1 000稀释)、兔抗p-GSK-3β抗体(1∶1 000稀释)、兔抗B-catenin 抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜，加入1∶1 000稀释的ALP标记的山羊抗兔IgG抗体，37 ℃孵育1 h；漂洗后加显色剂，避光显色2～5 min，有显色条带出现后用蒸馏水终止显色反应。以GAPDH作为内参，进行灰度值比较。

2 结果

2.1 益气活血方对CHF大鼠心功能的影响 药物干预4周后，与假手术组比较，模型组LVEDD和LVESD增加，LVEF、LVFS减少(P<0.01)；与模型组比较，益气活血方高剂量组与氯沙坦阳性对照组LVESD缩小(P均<0.01)，益气活血方高剂量组LVEDD缩小(P<0.05)，益气活血方低、高剂量组和氯沙坦阳性对照组LVEF和LVFS均升高(P<0.05或<0.01)。结果见表1。

表1 药物干预4周后各组心功能比较

注：与假手术组比较，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01。

2.2 益气活血方对CHF大鼠心肌Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin表达的影响 与假手术组比较，模型组大鼠心肌Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin的表达升高(P均<0.01)；与模型组比较，益气活血方低、高剂量组和氯沙坦阳性对照组大鼠心肌Dvl1、p-GSK-3β表达下降(P<0.05或<0.01)，益气活血方高剂量组和氯沙坦阳性对照组心肌β-catenin表达均下降(P均<0.05)。结果见表2。

表2 药物干预4周后各组心肌Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin表达比较

注：与假手术组比较，*P<0.05，△P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，▲P<0.01。

3 讨论

心衰是各种心脏结构或功能性疾病导致心室充盈和(或)射血能力受损而引起的一组综合征。其是一个慢性的发展过程，且病因及病机也复杂多变，中医学在疾病的诊疗中强调“整体观念”及“辨证论治”思想，恰恰符合了这种研究思路。关于本病的病因病机，《灵枢·经脉篇》记载为“手少阴气绝则脉不通，脉不通则血不流。”《景岳全书·惊悸怔忡》云：“心脾血气本虚，而或为怔忡……心虚血少，神志不宁而惊悸。”《血证论》云：“血积既久，其水乃成。”CHF多发于中老年人，缘由中年之后，脏气渐衰，或久病体虚，伤耗心气，导致心脏功能日渐衰竭。现代多数医家认为，心气亏虚、瘀血阻滞为本病的关键病机[6,7]。CHF发病早期，病变以气虚血瘀为主；中期在气虚血瘀的基础上，继发痰浊、火热等致病因素，加剧了患者本身虚实夹杂的病机状态；晚期久病，阴阳皆损。有关CHF患者中医证候分布规律研究表明，CHF以气虚血瘀证为主[8,9]。结合以前的实验研究，笔者认为益气活血法是治疗心衰的根本。

益气活血方是本院根据此病机特点研制的中药制剂。该方组方严谨，方中君药黄芪，功善补气升阳、利水消肿，故能振奋心阳、化气利水。党参、炙甘草健脾益气为臣药，能增强黄芪补中益气之功，以助血行，取“气为血之帅，气行则血行”之意。川芎善于活血行气、赤芍强于散瘀止痛，二者合用后可加强活血化瘀的功用；而祛瘀过猛易伤正，配以养血益气之品丹参，使祛瘀而不伤正，且三者为同类，可达到相辅相成之效，共为佐药。五味子和麦冬能养阴护心，滋养心血，与丹参一起避免化瘀药物走窜耗气伤津血；茯神甘以入心，功善益气养血，使心神得养，故均为使药。诸药合用，虚实兼顾，攻补兼施，共奏补心益气、活血利水之功。

近年来大量研究表明，Wnt/β-catenin信号通路在心肌梗死后心室重塑中持续过度激活，从而加速心衰的进程[10,11]。Wnt/β-catenin信号通路是一条多元复杂的级联放大信号传导通路，参与调控多种生物学过程。Dvl1是Wnt/β-catenin信号通路中将胞外信号传递到胞内的关键性信号分子。当细胞受到外界刺激，Dvl1可通过抑制GSK-3β活性来阻止β-catenin被磷酸化而降解，进而在胞质中大量聚集并入核，启动下游靶基因的表达并发挥相应的生物学作用[12,13]。β-catenin为Wnt/β-catenin信号通路中起着调控转录活性的核心成员，当β-catenin处于高表达状态时，Wnt/β-catenin信号通路就处于激活状态，相反则为抑制状态[14]。GSK-3β是决定胞质内β-catenin磷酸化及稳定的重要激酶，为该信号通路的负性调控因子[15]。研究[16]发现，Wnt/β-catenin信号通路的分子参与并调控完整的心肌细胞从出生到凋亡的各个过程。生理状态下，Wnt/β-catenin信号通路通常是静止的，而在心血管疾病状态下可被异常激活[17]。Dvl-1表达水平增加可诱导心肌细胞的肥大，而心肌肥厚后心室重塑是心衰发生发展的重要环节。在心肌纤维化中，GSK-3β活性明显增强[18]，而心肌纤维化是心衰的共同病理学改变。在损伤心肌凋亡细胞中，β-catenin水平呈时间依赖性增加[19]。因此，在心肌梗死后CHF的进程中，Wnt/β-catenin信号通路起重要作用。本实验提示益气活血方在CHF治疗中可抑制Wnt/β-catenin信号通路中Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin的过表达，表明益气活血方具有改善心功能、延缓心衰发展的疗效。

综上可见，益气活血方可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路中Dvl1、p-GSK-3β和β-catenin的过表达来改善心衰早期心肌形态学的重构、心肌纤维化和心脏的舒缩功能，但其具体机制仍需进一步探索。