鼻咽癌组织JAK2、STAT3表达变化及其临床意义

庄妍，谢小缺，章超

1 安徽省第二人民医院，合肥230000；2 安徽医科大学第一附属医院；3 安徽医科大学第二附属医院

鼻咽癌是一种发生于鼻咽部黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，全世界每年鼻咽癌新发病例约8万例，死亡达5万例[1]。我国鼻咽癌的发病率和病死率均高于世界平均水平。根据全国肿瘤登记中心数据显示，2014年新发鼻咽癌病例约4.5万例、死亡约2.4万例[2]。由于鼻咽癌病灶较为隐匿，早期临床症状无特异性，多数患者就诊时已进展至中晚期，放射治疗效果较差且易出现局部复发或远处转移。因此，深入研究鼻咽癌发生、发展的分子机制，寻找鼻咽癌早期诊断、个体化治疗和预后评估的肿瘤标志物具有重要意义。Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)是一种胞质酪氨酸激酶，广泛参与细胞因子受体超家族成员的信号传递。JAK2是JAK家族成员之一，其基因定位于染色体9p24.1，编码的蛋白具有非受体蛋白酪氨酸激酶活性，能够参与IL-6、IFN-γ等细胞因子受体信号传导途径的信号传导。有研究表明，乳腺癌组织中存在JAK2信号传导途径过度激活现象，通过激活下游的信号通路，促进靶基因表达，如趋化因子2(CCL-2)；而CCL-2能够招募肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞，从而发挥免疫抑制作用[3]。有研究报道，JAK2信号传导途径过度激活可能与鼻咽癌患者预后不良有关[4]，提示JAK2可能参与鼻咽癌的恶性进展。信号转导和转录激活因子3(STAT3)是一种信号转导蛋白和转录激活物，其基因定位于染色体17q21.2，编码的蛋白主要通过受体酪氨酸激酶磷酸化后活化，以二聚体形式发挥核内靶基因表达调控作用。研究表明，活化的STAT3能够激活下游细胞因子信号转导蛋白等基因表达，促进肝癌、鼻咽癌等恶性肿瘤的发生、发展[5]。本研究观察了鼻咽癌组织JAK2、STAT3 mRNA表达变化，并探讨其表达与患者临床病理特征和预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年2月～2016年2月安徽省第二人民医院和安徽医科大学第一附属医院收治的鼻咽癌患者85例。所有患者经鼻内镜下活检或术后组织病理检查明确诊断。纳入标准：①符合鼻咽癌诊断；②初诊，入院前未接受任何抗肿瘤治疗；③一般状况良好，Karmofsky评分≥70分；④临床病理资料和随访资料完整。排除标准：①合并心、肝、肾等重要脏器严重功能障碍者；②合并其他部位恶性肿瘤或严重感染性疾病者；③入院前接受任何抗肿瘤治疗者；④近期有外伤或手术史者；⑤临床病理资料或随访资料不完整者。其中，男50例，女35例；年龄18～74(48.1±7.2)岁，≤60岁41例、>60岁44例；有吸烟史28例，无吸烟史57例；组织分化程度：高分化23例，中分化29例，低分化33例；TNM分期[6]：Ⅰ、Ⅱ期61例，Ⅲ、Ⅳ期24例；有淋巴结转移44例，无淋巴结转移41例。本研究经安徽省第二人民医院和安徽医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准，患者或其家属知情同意。

1.2 JAK2、STAT3 mRNA表达检测 采用RT-qPCR法。取鼻咽癌组织和癌旁正常组织各50～100 mg，采用TRIzol法提取组织总RNA，经NanoDrop2000超微量分光光度计鉴定，提取的总RNA浓度和纯度合格，可用于后续实验。按PrimeScriptTMRT Reagent Kit说明，将总RNA逆转录为cDNA。逆转录反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA为模板，按SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒说明进行PCR扩增。所有引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。引物序列：JAK2上游引物5′-TCTGGGGAGTATGTTGCAGAA-3′，下游引物5′-AGACATGGTTGGGTGGATACC-3′；STAT3上游引物5′-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3′，下游引物5′-AAACACCAAAGTGGCATGTGA-3′；GAPDH上游引物5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游引物3′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-5′。PCR反应体系共20 μL：2×SYBR®Premix Ex Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，去离子水3.5 μL；反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s、60 ℃退火60 s、72 ℃延伸30 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 随访 鼻咽癌患者出院后以门诊或电话等形式定期随访，每3个月随访1次，随访截至2019年2月，统计患者生存情况，计算3年总体生存率。

2 结果

2.1 鼻咽癌组织与癌旁正常组织JAK2、STAT3 mRNA表达比较 鼻咽癌组织与癌旁正常组织JAK2 mRNA相对表达量分别为1.410±0.232、0.472±0.113，STAT3 mRNA相对表达量分别为0.945±0.137、0.427±0.101。鼻咽癌组织JAK2、STAT3 mRNA相对表达量均明显高于癌旁正常组织(t分别为26.754、23.261，P均<0.01)。

2.2 鼻咽癌组织JAK2 mRNA表达与STAT3 mRNA表达的关系 Pearson线性相关分析显示，鼻咽癌组织JAK2 mRNA相对表达量与STAT3 mRNA相对表达量呈正相关关系(r=0.622，P<0.01)。

2.3 鼻咽癌组织JAK2、STAT3 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 鼻咽癌组织JAK2、STAT3 mRNA相对表达量均与TNM分期有关(P均<0.05)，而与性别、年龄、吸烟史、组织分化程度、淋巴结转移无关(P均>0.05)。见表1。

表1 鼻咽癌组织JAK2、STAT3 mRNA表达与患者临床病理特征的关系

2.4 鼻咽癌组织JAK2、STAT3 mRNA表达与患者预后的关系 截至随访日期，共随访1～36个月，中位随访时间32个月。

以JAK2 mRNA相对表达量的均数1.410为临界值，将鼻咽癌患者分为JAK2 mRNA高表达者43例、低表达者42例，其3年总体生存率分别为51.2%(21/43)、83.3%(35/42)，JAK2 mRNA高表达者3年总体生存率明显低于JAK2 mRNA低表达者(χ2=3.874，P<0.05)。见图1。

以STAT3 mRNA相对表达量的均数0.945为临界值，将鼻咽癌患者分为STAT3 mRNA高表达者41例、低表达者44例，其3年总体生存率分别为48.7%(20/41)、79.5%(35/44)，STAT3 mRNA高表达者3年总体生存率明显低于STAT3 mRNA低表达者(χ2=4.916，P<0.05)。见图2。

图1 鼻咽癌不同JAK2 mRNA表达者的生存曲线

3 讨论

鼻咽癌是起源于鼻咽部黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，其发生可能是环境因素和遗传因素共同作用的结果[7]。目前认为，鼻咽癌是一种多基因遗传性疾病，其发生、发展可能涉及细胞内多条细胞信号传导通路的异常改变，如Wnt通路、Akt通路等[8]，但其确切分子机制仍不十分清楚。因此，深入研究鼻咽癌发生、发展的分子机制，寻找鼻咽癌早期诊断、个体化治疗和预后评估的肿瘤标志物具有重要意义。

图2 鼻咽癌不同STAT3 mRNA表达者的生存曲线

JAK2为JAK家族成员之一，其基因定位于染色体9p24.1，编码的蛋白具有非受体蛋白酪氨酸激酶活性，通过参与IL-6、IFN-γ等细胞因子受体信号传导途径的信号传导，参与调控细胞增殖、凋亡等生物学行为[9]。近年研究发现，JAK2异常表达能够促进肿瘤血管生成、上皮间质转化和细胞外基质降解等，参与肿瘤的发生、发展过程[10]。逄明杰等[11]研究发现，鼻咽癌组织JAK2异常高表达，其高表达与患者预后不良有关。本研究结果发现，鼻咽癌组织JAK2 mRNA相对表达量明显高于癌旁正常组织，进一步证实JAK2异常高表达与鼻咽癌的发生密切相关。这可能与肿瘤微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞分泌产生IL-17，而IL-17能够作用于肿瘤细胞表面相应受体，通过激活细胞内JAK2表达促进下游信号传导[12]。此外，肿瘤的发生、发展过程中存在多种调控JAK2表达的微小RNA异常表达，如能够结合于JAK2信使RNA的3′端非翻译区的miR-375，其异常低表达可导致JAK2表达升高[13]。本研究发现，鼻咽癌组织JAK2 mRNA相对表达量与TNM分期有关，而与性别、年龄、吸烟史、组织分化程度、淋巴结转移无关。表明JAK2异常表达与鼻咽癌TNM分期有关，其机制可能与JAK2表达升高能够促进下游细胞信号转导通路活化，如PI3K/AKT信号通路，导致上皮间质转化相关基因表达异常，从而促进肿瘤恶性进展[14]。本研究发现，JAK2 mRNA高表达者3年总体生存率明显低于JAK2 mRNA低表达者，提示JAK2高表达可能与鼻咽癌患者预后不良有关。这可能与JAK2高表达的肿瘤细胞侵袭能力明显增强有关。

STAT3是一种信号转导蛋白和转录激活物，其基因定位于染色体17q21.2，编码的蛋白主要通过受体酪氨酸激酶磷酸化后活化，形成同源性二聚体结构，由细胞质转运至细胞核，发挥核内靶基因表达调控作用。有研究报道，鼻咽癌组织STAT3表达明显升高，其表达变化与肿瘤分期、淋巴结转移和患者预后有关[15]。本研究结果发现，鼻咽癌组织STAT3 mRNA相对表达量明显高于癌旁正常组织，进一步证实STAT3异常高表达与鼻咽癌的发生密切相关，其机制可能是调控STAT3表达的上游细胞信号传导通路过度活化，如JAK2信号传导通路等，从而导致STAT3表达增加。此外，STAT3表达还受一些内源性抑制因子的调控，如STAT3的内源性抑制因子细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)。SOCS1能够抑制STAT3表达，进而抑制下游信号传导通路活化[16]。有研究表明，STAT3能够抑制参与DNA修复相关基因Jab1/Csn5表达，导致肿瘤恶性进展，并且降低肿瘤细胞对放化疗的敏感性[17]。本研究结果发现，鼻咽癌组织JAK2 mRNA相对表达量与TNM分期有关，而与性别、年龄、吸烟史、组织分化程度、淋巴结转移无关。表明STAT3异常表达与鼻咽癌TNM分期有关，其原因可能与STAT3能够参与调控肿瘤相关基因表达有关。本研究发现，STAT3 mRNA高表达者3年总体生存率明显低于STAT3 mRNA低表达者，其原因可能是上游转录因子等直接促进STAT3表达，如DNA甲基转移酶1、Zeste同源染色体2增强子基因等，从而促进鼻咽癌细胞无限增殖，进而导致患者预后不良[18]。

本研究还发现，鼻咽癌组织JAK2 mRNA相对表达量与STAT3 mRNA相对表达量呈正相关关系，提示二者可能共同促进肿瘤进展。目前，二者在鼻咽癌中确切的相互作用机制尚不清楚，可能是JAK2在受到上游信号激活后，STAT3被磷酸化而活化，导致下游Bax/Bcl-xL升高，从而促进肿瘤细胞增殖并抑制其凋亡，同时促进上皮间质转化等，继而导致肿瘤恶性转化[19]。

综上所述，鼻咽癌组织JAK2、STAT3高表达，其表达变化与TNM分期和患者预后有关。JAK2、STAT3有可能成为诊断鼻咽癌的肿瘤标志物和治疗靶标。