CA-Ⅸ与Ki-67在膀胱癌中的表达及意义

向安平，陈晓农，姚佳凯，沈悦凡，邱佳辉

（湖州市第一人民医院，浙江 湖州 313000）

CA-Ⅸ是CA家族中的一员，表达于细胞膜上，在人体细胞中参与二氧化碳与碳酸氢盐的反应[1]，主要用于调节细胞在缺氧环境下的酸碱平稳，使细胞耐受缺氧状态[2]。研究发现，CA-Ⅸ是一种新型的肿瘤抗原，在肿瘤中广泛表达[3-4]，参与肿瘤的形成与侵袭，使肿瘤在缺氧的环境下仍有较强的生存能力[5]。Ki-67抗原是一种细胞分裂增殖的相关蛋白，在增殖细胞的各个阶段均有表达[6]，是目前最被认可的一种恶性肿瘤标志物，表达强度与恶性度有关，并可提示患者的预后[7-8]，章萍萍等[9]发现，CA-Ⅸ在膀胱癌组织中亦有显著表达。本文探讨CA-Ⅸ与Ki-67在慢性膀胱炎及膀胱癌中的表达，以及对膀胱癌的诊断意义，为寻找膀胱癌肿瘤标记物提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2018年5月-2019年12月在本院病理诊断为慢性膀胱炎患者60例，膀胱癌84例。慢性膀胱炎组男26例，女34例；年龄34-76岁，平均（56.4±12.2）岁；膀胱癌组男 63 例，女 21例；年龄 30-90 岁，平均（62.7±11.6）岁；采用 WHO 2004分级法进行组织学分级[10]：低级别35例，高级别49例；采用2009 TNM 分期系统（UICC）[11]进行病理学分期：≤T149例，＞T135例，患者术前均未接受过任何放化疗、免疫治疗或靶向治疗。

1.2 方法 试剂：兔抗人CA-Ⅸ多克隆抗体、鼠抗人Ki-67单克隆抗体、免疫组织化学En Vision试剂盒、DAB显色剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。取存档蜡块，4μm连续切片3张，1张行HE染色，另2张切片贴于经L-多聚赖氨酸预处理的玻片上，切片脱蜡至水，过氧化酶阻断溶液室温孵育，PBS浸泡冲洗，置于0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）中微波修复，冷却至室温。10%正常山羊血清封闭，室温孵育，滴加CA-Ⅸ和Ki-67一抗（1:100）4℃过夜。滴加生物素标记二抗，再滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素。DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片。用已知的阳性切片作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。实验步骤严格按试剂说明书操作。

1.3 结果判定 CA-Ⅸ表达于细胞膜，Ki-67表达于细胞核，染色为淡黄色至深棕色为阳性表达。每张切片随机选取10个高倍视野，计数细胞总数以及阳性细胞数，按阳性细胞所占百分比计分：＜10%为0分，10%～50%为1分，51%～75%为2分，76%～100%为3分；根据染色强度评分：无染色为1分，浅染色为2分，中等染色为3分，深染色为4分。阳性细胞百分比评分与染色强度评分乘积作为最终评分结果：≤3分为不表达，4-6分为低表达，7-12分为高表达，低表达和高表达均为阳性表达。由两名高年资病理科医生采用双盲法阅片。

1.4 统计学处理 采用SPSS 21.0统计软件进行统计学处理，资料符合正态分布，采用χ2检验。

2 结果

2.1 CA-Ⅸ和Ki-67的表达 CA-Ⅸ在慢性膀胱炎症组织和膀胱癌组织中的阳性表达率分别为13.3%（8/60）和 63.1%（53/84），两组差异有统计学意义（P＜0.05）；Ki-67在慢性膀胱炎症组织和膀胱癌组织中的阳性表达率分别为25.0%（15/60）和84.5%（71/84），两组差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图1-4。

图1 CA-Ⅸ在膀胱炎症组织中局灶表达，为细胞膜表达（EnVision，×200）

图2 CA-Ⅸ在膀胱癌组织中弥漫性表达，为细胞膜表达（EnVision，×200）

图3 Ki-67在膀胱炎症组织中个别表达，为细胞核表达（EnVision，×200）

图4 Ki-67在膀胱癌组织中广泛表达，为细胞核表达（EnVision，×200）

2.2 与临床参数的关系 CA-Ⅸ在低级别与高级别中的阳性表达率分别为48.6%（17/35）与73.5%（36/49），分化为高级别者CA-Ⅸ阳性表达率较高，两者有统计学意义（P＜0.05），在年龄、性别、临床T分期、肿瘤大小、肿瘤数量、淋巴结有无转移方面阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05）；Ki-67在低级别与高级别中的阳性表达率分别为74.3%（26/35）与 91.8%（45/49），Ki-67 在≤T1与＞T1的分期中阳性表达率分别为77.6%（38/49）与94.3%（33/35），分化为高级别者、T 分期＞T1者阳性表达率较高，差异均有统计学意义（P＜0.05），在年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤数量、淋巴结有无转移方面，差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表1。

表1 膀胱癌组织中不同临床特征CA-Ⅸ和Ki-67的阳性表达（例）

3 讨论

CA-Ⅸ是由酸性氨基酸构成的一种跨膜糖蛋白，是一种细胞膜表达蛋白[12]。正常情况下，CA-Ⅸ参与二氧化碳与碳酸氢盐的反应，维持细胞内外的酸碱平稳。在癌细胞中，由于细胞快速增殖与营养血管的不平稳，导致癌细胞处于缺氧状态，低氧可诱导CA-Ⅸ过量表达，使癌细胞耐受低氧环境，保持癌细胞内pH值相对稳定。缺氧和低pH值环境可促进癌细胞的浸润及转移[13]。缺氧同时造成体内发生一系列反应、分泌多种细胞因子，从而降低细胞粘附，增加血管形成，提高了癌细胞存活能力，易浸润及转移。已有多项研究揭示，CA-Ⅸ可在多种恶性肿瘤中高表达，CA-Ⅸ的表达与肾癌、肺癌、乳腺癌等迁移和侵袭有关[14-15]。CA-Ⅸ有望成为抗癌治疗中一个有意义的靶点，为靶向药物研制提供新的方向。

本研究显示，CA-Ⅸ在膀胱癌中的阳性表达率（63.1%）明显高于慢性膀胱炎（13.3%）（P＜0.05），并且CA-Ⅸ在膀胱癌分化程度高级别中的阳性表达率明显高于低级别（P＜0.05）。因此，CA-Ⅸ可作为慢性膀胱炎与膀胱癌、以及作为膀胱癌分化程度的良好鉴别指标，膀胱高级别癌往往浸润能力强，容易复发，最终需行根治性膀胱全切术及全身化疗，术前结合CA-Ⅸ表达强度可以为手术方式的选择提供参考。

Ki-67表达于细胞核内，是一种与细胞增殖相关的抗原，除G0期以外，在细胞增殖的其它周期中均有表达。研究表明，Ki-67广泛表达于多种恶性肿瘤细胞，与恶性肿瘤的增殖密切相关[16-17]。本研究显示，Ki-67在膀胱癌组织中的阳性表达率（84.5%）显著高于膀胱慢性炎症组织中的表达 （25.0%）（P＜0.05）。因此，Ki-67可用于鉴别膀胱癌与膀胱慢性炎症。另外，Ki-67在高级别中的阳性表达率（91.8%）显著高于低级别的表达率（74.3%），＞T1分期的阳性表达率（94.3%）显著高于≤T1分期的阳性表达率（77.6%）。故Ki-67的表达反映了膀胱癌组织的增殖能力。指南推荐临床分期≤T1的患者行电切手术，＞T1的患者行膀胱全切术，Ki-67可为选择合理的治疗方案提供参考。

综上所述，CA-Ⅸ与Ki-67可用于鉴别慢性膀胱炎与膀胱癌，并且CA-Ⅸ在膀胱癌分化程度中高级别的阳性表达率要显著高于低级别；Ki-67在高级别中的阳性表达率显著高于低级别，＞T1分期的阳性表达率显著高于≤T1分期，对预后的判断和手术方法的选择有一定的指导作用。