应用计算机模拟研究牛膝在骨关节炎中的痿痹同治作用

郑春松，叶蕻芝，叶锦霞，付长龙*

1 福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122；

2 福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州350122

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是中老年常见的慢性退行性骨关节疾病，其主要病理特点为关节软骨的退变性病变和继发性的骨质增生，属于中医“骨痹”“膝痹”的范畴［1］。 本课题组前期基于陈可冀学术思想之OA 研究，认为OA 中的关节软骨退变临床表现为“痿”，骨质增生临床表现为“痹”，提出了OA 的核心病机为本痿标痹，揭示了痿痹同治在OA 治疗中的重要意义［2］。 因此，开展痿痹同治的中药研究成为热点。

牛膝作为治疗OA 常用方药独活寄生汤的重要组成中药［3］，在《神农本草经》中被列为上品，既能活血祛瘀，又能补益肝肾，强筋壮骨，兼能祛风湿，用于治疗腰膝酸痛和下肢痿软［4］。临床试验表明，牛膝醇提物离子导入治疗膝骨关节炎，取得很好疗效［5］。现代研究表明，牛膝醇提物能刺激软骨细胞增殖，增加软骨中Ⅱ型胶原表达，恢复软骨基质成分，稳定潮线结构，改善关节粘连，修复软骨损伤［6］，提示牛膝具有治痿的作用。 此外，牛膝正丁醇提取部位具有显著的抗炎镇痛作用［7］，提示牛膝存在治痹的作用。 但是，有关牛膝治痿和治痹的活性成分和作用靶点未见报道。因此，本文以OA 的核心病机本痿标痹为切入点，利用计算机模拟方法［8-10］，从分子水平探讨牛膝痿痹同治的药效物质基础、作用靶点及作用方式，揭示其在OA 中痿痹同治的作用，为其治疗OA 的临床应用和新药开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

牛膝化学成分和治痿、治痹药物分子数据集；OA 治痿和治痹相关靶点。

1.2 研究工具

本研究基于Windows 系统的计算模拟与数据建模平台Discovery StudioTM（简称DS）完成相关计算。 计算过程中除非特别说明，所选用的参数均为缺省值。 所有计算工作皆在北京大学化学与分子工程学院计算机模拟实验室完成。

1.3 方法

1.3.1 牛膝化学成分和治痿、治痹药物的分子数据集建立 从中国知网和PubMed 等数据库中，检索牛膝的化学成分73 个［11-14］；从DrugBank 数据库中搜索与OA 治疗相关的药物31 个，其中，主要作用为刺激关节软骨中蛋白多糖合成的药物3 个，以及抗炎镇痛的药物28 个，见表1。 在DS 模拟平台上，搭建三维分子结构，用Merck Molecular Force Field（MMFF）力场优化，建立牛膝化学成分和治痿、治痹药物的分子数据集［15］。

表1 治痿和治痹的药物信息Table 1 The drugs information of treating Wei syndrome and Bi syndrome

1.3.2 牛膝化学成分在治痿、治痹药物分子的化学空间分布 在DS QSAR 模块下，选择碳原子数、氧原子数、氮原子数、分子量、氢键受体数目、氢键给体数目、脂水分配系数、可旋转键数目和环数目等描述符48 个［16］，来计算治痿和治痹药物分子数据集的多维描述符值，此多维空间分别定义为治痿和治痹药物分子的化学空间［17］。 同时，按上述方法，建立牛膝化学成分数据集的化学空间。 利用主成分分析（principal component analysis，PCA）［18］，将上述数据集的描述符多维数据有效映射到三维化学空间上，分析牛膝化学成分与治痿、治痹药物分子的分子数据集化学空间的异同。

1.3.3 牛膝中治痿和治痹化合物-靶点网络的构建与分析 根据治疗靶数据库（Therapeutic Target Database）［19］和相关文献［20-21］，确定与治痹直接 相 关IL-1β、IL-6、TNF-α，以及治痿直接相关MMP-1、MMP-3、TGF-β1 为靶点，在RCSB Protein Data Bank上［22］，分别下载其结构（表2）。 在DS 模拟平台中［23］，蛋白结构去溶剂、去配体、加氢处理后，以其所含的活性原配体来确定活性位点； 在DS Ligand-Fit 模块中［24］，使用蒙特卡罗方法对牛膝化学成分数据集进行构象采样、Dreiding 力场下进行打分，保留DOCK-SCORE 最高的构象。 以各自原配体DOCKSCORE 为阈值，筛选牛膝中治痿和治痹的潜在活性化合物。 将牛膝中活性化合物及其作用靶点视为节点，两者的相互作用用边表示。 采用Cytoscape软件［25］，构建牛膝的治痿化合物-靶点网络和治痹化合物-靶点网络，并在此软件的Network Analysis 模块下，分析牛膝中化合物与靶点作用情况。

表2 治疗骨关节炎的重要靶点Table 2 The important therapeutic targets of osteoarthritis

2 结 果

2.1 牛膝的化学空间特征

牛膝化学成分分子数据集在分子量、氢键受体数目、氢键给体数目和脂水分配系数等重要描述符值的分布范围均比治痿药物分子数据集、治痹药物分子数据集广，见表3、表4。 牛膝化学成分与药物数据集的化学空间（见图1）显示，相对于治痿和治痹的药物数据集，牛膝化学成分分子数据集在化学空间上具有更好的分散性，且在后方存在与治痿药物分子数据集相似或相近的化学空间，在底部存在与治痹药物数据集相似或相近的化学空间。

表3 牛膝化学成分分子数据集和治痿药物分子数据集的一些物理化学属性Table 3 Some physicochemical properties of chemical components dataset of Niuxi and drug dataset of treating Wei syndrome

表4 牛膝化学成分分子数据集和治痹药物分子数据集的一些物理化学属性Table 4 Some physicochemical properties of chemical components dataset of Niuxi and drug dataset of treating Bi syndrome

2.2 牛膝中治痿和治痹化合物-靶点网络

以表2 的蛋白为治疗OA 的虚拟药理筛选模型，建立了牛膝的治痿化合物-靶点网络（见图2）和治痹化合物-靶点网络（见图3），结果显示了牛膝的药效物质基础主要为皂苷类、 植物甾酮类、黄酮类和生物碱化合物等，且治痿和治痹的化合物个数分别为26 和37 个，其中，同时具有治痹和治痿作用化合物个数为20 个，且能作用的靶点数最大数达到6 个。表5 显示，牛膝中治痿化合物-靶点网络中重要化合物节点为黄芩苷，即牛膝中治痿的重要活性物质为黄酮类化合物，以及其重要靶点节点为MMP-1；表6 显示，牛膝中治痹化合物-靶点网络中重要化合物节点为葛根素、黄芩苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷和山柰酚-3-O-葡萄糖苷，即牛膝中治痹的重要活性物质为黄酮类化合物， 以及其重要靶点节点为IL-1β 和TNF-α。

图1 牛膝化学成分与药物数据集的化学空间分布Figure 1 The distribution of chemical components dataset of Niuxi and drug datasets in chemical space

图2 牛膝中治痿化合物-靶点网络Figure 2 The compound-target network of Niuxi in treating Wei syndrome

表5 牛膝中治痿化合物-靶点网络的重要节点信息Table 5 Key nodes information of the compound-target network of Niuxi in treating Wei syndrome

图3 牛膝中治痹化合物-靶点网络Figure 3 The compound-target network of Niuxi in treating Bi syndrome

3 讨 论

3.1 牛膝痿痹同治的研究意义

OA 治疗的目的主要有2 个方面：①缓解关节疼痛；②改善功能并重建受损的软骨及骨的结构［20］。前者主要是中医治痹的作用，常用非甾体类抗炎药，减轻疼痛，但长期使用存在胃肠不良反应［26］；后者主要是中医治痿的作用，常用氨基葡萄糖和硫酸软骨素等，保护关节软骨，但真正能够达到改善功能并重建受损的软骨和骨的结构的可靠药物还不多［27］。在OA 的不同阶段，痹与痿是可以转化、并存的［28］，这提示单用具有治痿或治痹的药物可能对OA 病情起不到很好的改善效果；中医药治疗OA 有着悠久的历史，且发挥出独特的优势、副作用少，特别是具有多组分、多靶点作用的中药，是药物开发和研究的宝藏［29-30］。 在治疗OA 的中药中，牛膝的使用频率最高［31］。 《神农本草经》中有关牛膝的记载：“主寒湿痿痹，四肢拘挛，膝痛不可曲伸……”［4］，提示其具有痿痹同治的作用。 因此，从牛膝中发现痿痹同治的多靶点药物，有望成为治疗OA 的新方向。

表6 牛膝中治痹化合物-靶点网络的重要节点信息Table 6 Key nodes information of the compound-target network of Niuxi in treating Bi syndrome

3.2 痿痹同治药物发现的研究靶点选择

痿痹同治药物发现的基础是寻找分子靶点。 一方面，从OA 疼痛入手，OA 炎性疼痛主要是炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 等）诱导的炎症引起的。随着疾病的进程，炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、TNFα 等）长时间刺激骨关节周围的末梢神经，可致OA神经病理性疼痛［21，32］。由此将IL-1β、IL-6 和TNF-α作为治痹的分子靶点。 另一方面，从软骨退化与软骨修复入手，MMPs 是一类与软骨Ⅱ型胶原的降解密切相关的关键酶［33-34］，其中，MMP-1 的过表达导致软骨Ⅱ型胶原的降解是软骨退变的重要原因，且MMP-3 可通过对间质胶原酶的激活来实现对软骨Ⅱ型胶原的降解，进一步加速软骨的破坏；TGF-β1是目前发现的最强细胞促生长因子，具有促进软骨细胞的增殖与分化、促进软骨基质的合成、以及修复软骨等功能，并能通过抑制MMPs 的合成来降低软骨基质的降解，在软骨的生长和重建中起着关键性作用［35］。因此，本研究将IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3 和TGF-β1 作为从中药中痿痹同治药物发现的研究靶点。

3.3 牛膝痿痹同治药效物质基础和作用靶点分析

图1 化学空间结果显示牛膝化学成分的化学空间具有很好的分散性，且与治痿、治痹药物的化学空间有较好的重叠或距离很近，依据定量构效关系理论［17］，提示牛膝具有广谱的作用，可能存在治痿、治痹的活性物质，因此，构建牛膝治痿和治痹化合物-靶点网络，来研究牛膝痿痹同治的药效物质基础和作用靶点。

牛膝中治痿化合物-靶点网络显示了牛膝中26个化合物节点，涵盖了皂苷类（如节点34，牛膝皂苷A）、植物甾酮类（如节点44，蜕皮甾酮）、黄酮类（如节点61，黄芩苷）、生物碱（如节点64，黄连碱）、甾醇类（如节点1，β-谷甾醇）、醌类（如节点47，大黄酚）和环烯醚萜苷类（如节点66，京尼平苷）；牛膝中治痹化合物-靶点网络显示了牛膝中37 个化合物节点，涵盖了皂苷类（如节点34，牛膝皂苷A）、植物甾酮类（如节点44，蜕皮甾酮）、黄酮类（如节点61，黄芩苷）、生物碱（如节点63，巴马亭）、甾醇类（如节点40，α-菠甾醇）、肽类［如节点72，环（酪氨酸-亮氨酸）］和环烯醚萜苷类（如节点66，京尼平苷）。 上述显示了牛膝中治痹比治痿存在更多的活性物质，提示牛膝的作用可能偏治痹，为牛膝归属于“活血化瘀药”提供了新依据；另外，治痿和治痹存在部分相同的化学物质，如皂苷类、植物甾酮类、黄酮类等，其中，实验已经证实了牛膝总皂苷具有治痿和治痹的作用［36-37］。鉴于牛膝醇提物中含有皂苷类、植物甾酮类、黄酮类等，上述也为牛膝醇提物离子导入治疗OA 提供了实验依据。而且，本文计算了网络节点的度和介数，用来评价化合物和靶点在网络中的重要性［38］。 表5、6 显示牛膝治痹的主要靶点和化合物分别为MMP-1 和黄芩苷，治痿的主要靶点和化合物分别为IL-1β、TNF-α 和葛根素，提示牛膝痿痹同治的关键作用靶点为MMP-1、IL-1β 和TNF-α，以及关键药效物质基础为黄酮类化合物，为后期牛膝痿痹同治实验研究提供方向。

3.4 牛膝痿痹同治的作用方式分析

从化合物-靶点网络可以看出，牛膝痿痹同治的作用方式可能有两种：第1 种是单个化合物同时作用于治痿和治痹靶点，即混杂药物［39］，如节点61（黄芩苷）能作用于IL-1β、IL-6、TNF-α、MMP-1、MMP-3和TGF-β1；第2 种是多种化合物组合作用于治痿和治痹靶点，即组合药物［39］，如节点44（蜕皮甾酮）能作用于MMP-1，节点13（阿魏酸）能作用于IL-6，两者组合可起到痿痹同治的作用。 上述为从牛膝中发现治疗OA 痿痹同治的多靶点药物和治疗新策略提供了依据，有助于牛膝的进一步开发利用。

4 小 结

本研究开展牛膝在OA 中痿痹同治作用的计算机模拟，分析了其药效物质基础、作用靶点及作用方式，直观揭示了牛膝治疗骨关节炎可能是通过类似混杂药物和组合药物的方式达到痿痹同治的多靶点作用。 在此基础上，课题组下一步将以改良Hulth造模法复制膝OA 和IL-1β 诱导的退变关节软骨细胞为模型［40-41］，以MMP-1、IL-1β 和TNF-α 为主要检测指标，进行“牛膝-黄酮有效部位-有效成分”的系统层次研究，验证模拟出来的潜在活性物质，最终创制痿痹同治的多靶点新药，进一步凸显牛膝在治疗OA 中的重要性。