二氢杨梅素纳米乳液的制备及性能评价

吴晓琼 ，崔晓钰 ，王强 ，夏强 *

1. 南京科技职业学院生物与环境学院（南京 210048）；2. 东南大学生物科学与医学工程学院（南京 210096）；3. 苏州纳米科技协同创新中心（苏州 215123）

二氢杨梅素又名蛇葡萄素，外观为白色粉末，结构式如图1。二氢杨梅素属于黄酮类化合物，存在于杨梅科、藤黄科以及柳科等植物中，其中藤茶尤为特别。研究表明：二氢杨梅素具有抗菌、护肝、抗氧化等功能。但其溶液稳定性较差，易氧化、生物利用率低等缺点，限制了其应用[1-4]。

图1 二氢杨梅素结构式

纳米乳液（Nanoemulsions，NE）与传统乳液类似，由油、水、乳化剂组成，乳化剂一般又分为主乳化剂和助乳化剂，是一类液相以液滴形式分算到另一相中形成的胶体分散体系。和传统乳液相比，纳米乳液的粒径更小，常在100 nm左右，较小的粒径赋予粒子更大的表面积，使得活性物更容易被吸收，可提高口服生物利用度，并可能增强活性物的效用[5-6]。研究主要制备二氢杨梅素纳米乳液，改善其溶解度、稳定性和生物利用度，使其在功能性食品领域发挥其应用。

1 材料与方法

1.1 材料

二氢杨梅素（98%），西安天丰生物科技有限公司；辛癸酸甘油酯，河南正通化工有限公司；聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯（吐温80），国药集团化学试剂有限公司；聚甘油蓖麻醇脂（PGPR），上海佑创实业有限公司；BS124S电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；扫描电子显微镜（SEM，FEI TecnaiG2F20S-Twin，USA）、单光束紫外可见分光光度计：755B型，上海菁华科技仪器有限公司；激光粒度仪（Laser Diffraction，LD），Malvem Mastersizer MS2000，英国马尔文仪器有限公司；磁力搅拌电热恒温水浴锅，EMS-30，上海乔跃电子有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 二氢杨梅素纳米乳液的制备

以辛癸酸甘油酯为油相1 g，加入二氢杨梅素0.02 g，同时加入Tween 80 0.6 g，PGPR 0.6 g，30℃下搅拌混合均匀，加入去离子水7.38 g，甘油0.4 g以900 r/min的转速搅拌15 min，即得到二氢杨梅素纳米乳液。

1.2.2 二氢杨梅素含量的测定

二氢杨梅素溶液的质量浓度为横坐标，样品在294 nm处的吸光度为纵坐标，绘制二氢杨梅素标准曲线，方程为y=0.050 8C-0.004 6，R2=0.999 5。

图2 二氢杨梅素的标准曲线

1.2.3 平均粒径和多分散指数

使用激光粒度仪，测量平均粒径（Mean particle size）和多分散指数（PDI）。多分散指数（PDI）是衡量体系中颗粒粒径分布宽度的一个指标。测试的角度是90°，测试的温度是25℃，平衡时间为3 min。所有粒径数据都是测试三次的平均值。

1.2.4 微观形貌观察

使用超纯水将新制备的纳米乳液稀释50倍，滴加到铜网上自然干燥，用质量分数为1%的磷钨酸溶液负染样品后置于样品室观察。

1.2.5 保留率的测定

采用超滤离心法测定二氢杨梅素纳米乳液的包封率。取400 μL样品于超滤离心管中在12 000 r/min转速下离心15 min，吸取滤液，用无水乙醇定容至10 mL，通过紫外分光光度计测定吸光度，根据标准曲线和稀释倍数关系计算出游离活性物的含量（Wf），然后根据公式（1）计算二氢杨梅素纳米乳液的包封率：

式中：EE为包封率；Wt为总活性物含量。

1.2.6 稳定性考察

（1）离心稳定性：将制备的复合维生素纳米乳液在 10 000 r/min下分别离心5，10，15和20 min，测其粒径、PDI。

（2）储存稳定性：将制备的复合维生素纳米乳液分别储存于4℃冰箱、常温（25℃）、40℃恒温箱中，每隔一段时间测其粒径、PDI。

1.2.7 抗氧化性试验

通过DPPH自由基清除试验来考察二氢杨梅素纳米乳液的抗氧化性，称取8 mg DPPH于100 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容。取三个西林瓶，分别编号为D、S和B，按表1加样并摇匀，在室温暗处反应30 min后，检测各瓶中液体在517 nm处的吸光度。假设D、S、B瓶中液体的吸光度分别为AD、AS、AB，则DPPH自由基清除率的计算方法见公式（2）：

表1 D、S、B瓶中液体的组成

1.2.8 体外模拟释放

使用透析袋法考察二氢杨梅素纳米乳液的体外释放性能。选用PBS缓冲溶液（pH 6.8）-乙醇（7∶3，V/V）作为释放介质。精确称取2 mL的样品于透析袋中，并用透析夹夹紧两端。将透析袋完全浸没在200 mL释放介质的烧杯中，在37℃的水浴条件下保持150 r/min的匀速磁力搅拌。分别在0.5，1，2，4，6，8，10，12和24 h从烧杯中取5 mL释放介质，对其中二氢杨梅素含量进行检测，并加入5 mL释放介质，保证烧杯中的释放介质总量不变。以时间为横坐标，二氢杨梅素释放量为纵坐标，绘制二氢杨梅素纳米乳液的体外释放曲线。以相同量的二氢杨梅素水溶液作为空白对照组。

2 试验结果

2.1 复合二氢杨梅素纳米乳液的基本参数

经测定，制备的二氢杨梅素纳米乳液的包封率为92.4%±0.4%。对二氢杨梅素纳米乳液的平均粒径进行了检测，平均粒径为86.85±0.54 nm，PDI为0.099± 0.002，通过透射电镜观察二氢杨梅素纳米乳液颗粒形貌结构，结果如图3所示。表明所制备的二氢杨梅素纳米乳液具有较小的粒径，且粒径分布均一。

图3 二氢杨梅素纳米乳液透射电镜图

2.2 稳定性考察

2.2.1 储存稳定性

通过对置于不同温度下的二氢杨梅素纳米乳液进行粒径和PDI的检测，考察制备的二氢杨梅素纳米乳液在4和25℃下的稳定性，选择合适的储存温度。试验结果如图4和图5所示，从图中可以看出，4和25℃下的的粒径基本变化不大，但25℃下的二氢杨素梅纳米乳液PDI波动较大，而4℃下二氢杨梅素纳米乳液较稳定，可能是因为温度较低时，分子热运动减弱，较少出现聚集。考察结果表明所制备的二氢杨梅素纳米乳液在低温下稳定性更好，最好在4℃下储存。

图4 二氢杨梅素纳米乳液在25℃下储存28 d的平均粒径和PDI变化

图5 二氢杨梅素纳米乳液在4℃下储存28 d的平均粒径和PDI变化

2.2.2 离心稳定性

离心法是一种简单且快速评价体系稳定性的方法。如图6所示，从图中可以看出，二氢杨梅素纳米乳液在不同的离心时间下，粒径无显著变化，无分层现象；且从PDI可以看出，体系内均没有出现较大颗粒的聚集。表明二氢杨梅素纳米乳液具有较好的离心稳定性。

图6 二氢杨梅素纳米乳液离心不同时间后的平均粒径和PDI变化

2.3 抗氧化性考察

抗氧化性是二氢杨梅素的主要功效之一，与其的应用具有重要的关系。试验选择DPPH自由基清除试验考察所制备的二氢杨梅素纳米乳液的抗氧化性能。DPPH是一种稳定性较好的以氮为中心的自由基，紫色，在517 nm处具有强吸收，当溶液中具有自由基清除剂时，DPPH会与其结合，致使溶液在517 nm处的吸光度降低，且降低量与清除DPPH的量呈线性关系。

表2为二氢杨梅素纳米乳液、二氢杨梅素乙醇溶液、空白纳米乳液对DPPH自由基清除率。从试验结果可以看出，空白的纳米乳液对DPPH自由基清除率很低，几乎不具备抗氧化性。而相对于二氢杨梅的乙醇溶液，二氢杨梅素纳米乳液的清除率出现了一定的降低。可能是制备过程中存在一些物质导致二氢杨梅素氧化，降低了二氢杨梅素的DPPH自由基清除率。

表2 不同样品的DPPH自由基清除率

2.4 体外释放研究

体外释放是考察微纳米载体性能的重要指标。本试验采用透析袋法考察二氢杨梅素纳米乳液的体外释放行为。本试验选择了PBS缓冲溶液（pH 6.8）-乙醇（7∶3，V/V）作为释放介质。试验结果如图7所示，从图中可以看出，在体外37℃二氢杨梅素纳米乳液24 h累计释放率为72.3%，而二氢杨梅素水溶液在12 h基本释放完全，说明二氢杨梅素纳米乳液具有一定的缓释作用。

图7 二氢杨梅素纳米乳液的累计释放曲线

3 结论

所制备的二氢杨梅素的平均粒径为86.85±0.54 nm，PDI为0.099±0.002，制备得到的体系中二氢杨梅素含量为0.191%±0.005%，包封率为92.4%±0.4%。通过对稳定性的考察，可以知道二氢杨梅素纳米乳液最好在低温下储存，且离心稳定性良好。抗氧化性能研究表明二氢杨梅素纳米乳液具有明显的抗氧化性能。体外释放的考察结果，表明二氢杨梅素纳米乳液对活性物具有缓释的效果。二氢杨梅素纳米乳液可提高生物利用率，为功能化食品提供了更大的可能性。