黑菊芋中5-羟甲基糠醛制备及含量分析

杨庆丽，张旭，石杰，董艳，张正海，姬妍茹*

黑龙江省科学院大庆分院（大庆 163319）

5-羟甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural，5- HMF）又称羟甲基糠醛、5-羟甲基-2-呋喃糠醛等，是葡萄糖，果糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水产生的醛类化合物，其稳定性不高，对空气和光敏感性高，需要在低温下保存[1-2]。5-HMF是美拉德反应终产物类黑精形成的中间体，广泛存在于蜂蜜、果汁、醋、乳制品、饼干和咖啡等烘焙食品中，尤其是碳水化合物含量丰富的食品[3]。目前，对于5-HMF仍有许多争议，其安全性引起了人们的关注。

菊芋（Jerusalem artichoke）又名洋姜、鬼子姜，菊科向日葵属，多年生草本植物。菊芋块茎菊糖含量丰富，约占干物质70%～90%[4]。有研究表明菊糖在加热情况下可转化成果糖进而生成5-HMF[5]。黑菊芋是菊芋块茎在变温条件下发生美拉德反应生成的一种新型食品。其色泽黑亮，口感香甜富有弹性，能够满足广大消费的需求，具有较好的市场前景。黑菊芋等热加工食品中5-HMF的相关研究显得尤为重要。因此，研究对黑菊芋加工及保存中5-HMF含量变化进行分析，并与几种常见的果脯及咖啡进行比较，以期为黑菊芋的食用安全性评价提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白皮菊芋，黑龙江省科学院大庆分院基地种植；甲醇（色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；5-HMF标准品，北京中科仪友化工技术研究院；黑菊芋、黑蒜，黑龙江省科学院大庆分院；嘉应子、乌酸梅，武汉稻香春食品厂；黑咖啡，德国格兰特；铁氰化钾（分析纯），沈阳市华东试剂厂；草酸、乙酸铅等为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Master-D UF实验室超纯水机，上海和泰仪器有限公司；LC-15C高效液相色谱，日本岛津；台式高速冷冻离心机，上海天美科学仪器有限公司；黑菊芋加工设备，黑龙江省科学院大庆分院自制；HPX-9082数显电热培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 黑菊芋中5-HMF提取方法优化

黑菊芋充分研磨后取1 g，分别以提取温度、料液比、提取时间、甲醇体积分数作为考察对象。采用单因素、正交试验，研究最佳提取参数。提取温度分别为25，30，35，40，45和50℃；料液比分别为1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8和1∶9（g/mL）；时间分别为1，2，3，4，5和6 h；甲醇体积分数分别为0（蒸馏水），10%，20%，30%，40%和50%；以5-HMF含量为指标测定提取率。

1.3.2 5-HMF含量分析

以1.3.1中的最优条件提取黑菊芋5-HMF后，提取液根据NY/T 1332—2007中6.1.2及6.1.3分析5-HMF含量[6]。HPLC上样分析色谱柱为C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇+水（15%+85%），流速为1.0 mL/min，检测波长280 nm，柱温室温，进样量10 μL。以5-HMF标准品质量为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.3 黑菊芋加工中5-HMF含量变化

新鲜菊芋洗净、切成厚度约1.5 cm左右的片，沥干水分后，装入耐高温塑料袋中，每袋500 g，放入黑菊芋加工设备中启动程序开始加工。分别于程序开始的0，4，8，12，24，72，120，168，216，264，312和360 h取样。分析不同加工时间5-HMF含量。

1.3.4 几种常见食品中5-HMF含量分析

分别称取不同保存时间黑菊芋、黑蒜、嘉应子、乌酸梅，黑咖啡各1 g，以1.3.2中方法分析5-HMF含量。

1.4 数据处理

利用Excel 2007作图，采用Graphpad Prism 5进行差异显著性分析。p＜0.05为显著性差异。p＞0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 5-HMF提取条件优化

由图1～图4可知，以浓度≥98%的5-HMF标准品绘制标准曲线，曲线方程为y=9 360.4x-7 035.7，R2= 0.999 4，随提取温度的升高，提取率显著增加（p＜ 0.05），40℃达到最高，含量为0.913 8 mg/g，之后保持稳中有降趋势（p＞0.05）。这可能是由于温度的升高促进了5-HMF在溶剂中的扩散速度，但是当达到一定阈值时则不再升高。因此选择35，40和45℃三个水平进行下一步正交试验。料液比单因素试验中，当料液比为1∶8（g/mL）时，提取率显著高于其他几组（p＜ 0.05），因此选择料液比1∶7，1∶8和1∶9（g/mL）三个水平进行正交试验。随提取时间增加，类黑精提取率逐渐升高，4 h之后基本保持稳定状态。因此选择3，4和5 h三个水平进行下一步正交试验。

图1 5-HMF标准曲线

图2 温度单因素试验

图3 料液比单因素试验

图4 时间单因素试验

由表1可知，提取温度、料液比，时间三个因素都会影响提取效果。因此，选取以上因素进行L9(34)正交试验。结果由表1可见，三个因素中料液比＞时间＞温度，但R值差异不大，表明三个因素对于提取率的影响度相当。最佳条件为，A2B2C3。最优方案在试验组中，结果为0.913 4 mg/g大于其他试验组。因此，最佳提取条件为40℃、1∶8（g/mL）、5 h。

2.2 黑菊芋加工和保存中5-HMF含量变化

由图5可知，5-HMF的生成是一个十分复杂的过程，在食品中主要通过两个途径，焦糖化反应[7]和美拉德反应[8]。这两种应均是以己糖为反应底物的，若为二糖或多糖则先水解为单糖再发生反应。菊芋中含丰富的菊糖，黑菊芋加工中通过发生上述两种反应能够形成5-HMF。研究中24～264 h时5-HMF含量显著增加（p＜0.05）与上述理论是相符的。随着加工进行，美拉德反应进入后期，5-HMF含量呈现稳中略降的趋势。这是由于生成了一种美拉德反应终产物类黑精。5-HMF是类黑精生成的中间产物[9]，在黑菊芋加工后期发生了转化。由表2可见，随保存时间加长，黑菊芋中有5-HMF含量显著降低（p＜0.05），这是由于5-HMF自身稳定性不好，可发生聚合反应或分解为乙酰丙酸和甲酸[10]。这些原因很好的解释了5-HMF在加工和保存中的变化趋势。

表1 正交试验设计

图5 黑菊芋加工中5-HMF含量变化

表2 不同保存时间黑菊芋中5-HMF含量变化

2.3 几种常见食品中5-HMF含量分析

5-HMF是一种呋喃类化合物，菊芋中含有的大量菊糖能够为5-HMF的生成提供物质基础。目前对于5-HMF的安全性仍存在争议。有研究认为，5-HMF能够造成DNA损伤[11]，具有潜在的致癌性[12]，能与人体蛋白质结合引起中毒，造成横纹肌麻痹和内脏损害[13]。有学者则认为5-HMF并不存在严重的健康危险，Janzowski等[14]的研究，5-HMF虽然能够使正常细胞内谷胱甘肽活性受到一定影响，但远远达不到给人体带来严重损害的程度。近年来的药理研究表明：5-HMF具有增强大鼠红细胞变形活性、抗氧化、改变血液流变，保护神经远等对人体有益的作用，作为有效成分制备抗心肌缺血的心血管病药品，已被中国药科大学作为专利进行申请[15]。研究分析了同种不同食品中5-HMF含量结果见表3，其中黑咖啡含量为4.949 4 mg/g显著高于保存0～18个月黑菊芋（p＜0.05），嘉应子与乌酸梅含量分别为0.981 9及0.803 8 mg/g与保存6个月黑菊芋相当。黑蒜含量介于保存0～3个月黑菊芋之间。这一结果能够为黑菊芋食用安全性提供佐证。另外，食用量方面，Abraham等[16]通过各种动物试验证明了5-HMF每天摄入量在80～100 mg/kg体质量范围内无不利影响，成人体质量按照60 kg计算，每天摄入量为4 800～6 000 mg的5-HMF不会对身体产生不利影响。折合后相当于7 433 g存放18个月的黑菊芋和5 302 g存放6个月黑菊芋中的5-HMF含量。而建议的黑菊芋食用量为成年人每天食用30～50 g。因此其食用安全性可以保证。3 结论

表3 不同食品中5-HMF含量分析

正交试验确定黑菊芋5-HMF最佳提取条件为；40℃、料液比1∶8（g/mL）、提取时间5 h。黑菊芋加工过程中，菊芋中菊糖发生了美拉德反应，5-HMF含量呈先显著升高后稳中有降趋势，这是由于反应后期5-HMF转化成了黑菊芋的呈色物质类黑精。5-HMF性质不稳定，随保存时间加长含量逐渐降低。各保存时间含量均显著低于黑咖啡。保存6个月后黑菊芋与嘉应子及乌酸梅等常见果脯含量相当。黑菊芋具有食用安全性，对人体不存在严重的健康威胁。