Auer小体阳性与阴性初治非AML-M3型原发急性髓系白血病临床特点对比分析*

姜艳红， 焦扬， 陈光意， 盛家和， 许青霞

郑州大学附属肿瘤医院检验科(河南郑州 450008)

急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是由于造血干细胞发生了染色体畸变、融合基因形成和(或)同时存在体细胞突变等异常事件，导致正常造血干细胞的增殖失控、分化受阻及调控异常，从而促使其恶性转化并且无限增殖的一类高度异质性血液系统疾病。Auer小体是1906年由美国医师John Auer发现，该物质比较常见的，是由嗜苯胺蓝颗粒融合而成的杆状物资，此外，也会有其他的形状存在，如颗粒状等等，颜色可以为紫红色。在AML中有高度特异度[1]，以往文献对有无Auer小体的AML患者实验室、临床以及预后特点的总结不完全一致，现收集我院近年来初治原发AML(非AML-M3)患者，对比分析Auer小体阳性与阴性AML患者的实验室、临床和预后特点，希望所得结果能对AML患者的诊治有所帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月至2017年12月河南省肿瘤医院血液科所有初治原发AML住院患者325例，所有患者经细胞形态学、免疫学、遗传学、分子生物学分析，AML诊断和疗效标准参照WHO[2]和张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》[3]，除去AML-M3患者，符合要求患者248例，包括男145例，女103例，年龄1～80岁。本研究均获得患者知情同意，并经我院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 患者临床资料 通过查阅病历获得。

1.2.2 细胞形态学检查 抽取外周血和骨髓液制涂片，快速干燥后进行瑞氏染色，根据需要进行特殊细胞化学染色，包括过氧化物酶、碱性磷酸酶、特异度酯酶、非特异度酯酶及糖原染色等，进行形态学分型。

1.2.3 免疫学分型检查 抽取骨髓液2 mL并用肝素抗凝，应用流式细胞仪和荧光标记的单克隆抗体检测白血病细胞的表面抗原，并通过计算幼稚细胞抗原的表达比例来确定阳性细胞数；以细胞胞膜抗原表达比例≥20%，胞浆抗原表达比例≥10%为标准，计算抗原的阳性率。

1.2.4 细胞遗传学检查 通过骨髓细胞直接法和(或)24 h培养法，按照常规制备染色体，正常核型至少要分析20个分裂象，异常核型至少要分析10个分裂象。核型异常描述依据《人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN 2013)》的规定进行[4]。

1.2.5 分子生物学检查 通过荧光定量PCR检测AML相关融合基因，采用二代测序方法检测WT1、c-KIT、FLT3-ITD、FLT3-TKD等AML相关基因突变。

1.2.6 治疗 AML患者分别接受HAA(高三尖杉酯碱、阿克拉霉素、阿糖胞苷)、DA(去甲氧柔红霉素、阿糖胞苷)、MA(米托蒽醌、阿糖胞苷)等标准方案化疗，部分患者缓解后接受自体或异基因造血干细胞移植。

1.2.7 疗效评价 诱导化疗后3～4周进行骨髓检查评价疗效，完全缓解(CR)患者给予巩固化疗，部分缓解(PR)和原始细胞下降>50%者给予第2次诱导化疗，2个疗程后进行疗效评价。

1.2.8 疗效评价标准 完全缓解(CR)、形态学完全缓解而血细胞计数未完全恢复(CRi)、部分缓解(PR)、治疗失败。

1.2.9 随访 所有入选患者随访至2018年12月31日，总生存期(OS)通过查阅病历或打电话获取。

2 结果

2.1 一般临床特点分析 本研究入组248例患者，根据骨髓细胞形态学检验结果有Auer小体，分为Auer小体阳性组(ARPG)和Auer小体阴性组(ARNG)，从性别、年龄、既往病史、发热、出血情况、肢体疼痛、贫血症状、心血管疾病症状、呼吸系统疾病症状、消化系统疾病症状和神经系统疾病症状对两组患者进行对比分析，发现两组间心血管疾病症状和消化系统疾病症状的差异有统计学意义(P<0.05)，其余临床特点在两组间的差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 一般临床特点 例(%)

2.2 实验室检查结果特点分析 本研究从AML患者血常规、骨髓细胞形态、染色体核型预后、常见AML融合基因、常见AML基因突变和FAB分型对ARPG和ARNG进行实验室特点对比分析，发现染色体预后良好和预后中等核型、融合基因AML-ETO、突变基因NPM1和c-KIT、FAB分型中的M2和M5在两组间的差异有统计学意义(P<0.05)，其他实验室特点在两组间的差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3 诱导缓解治疗情况对比分析 本研究248例患者中有5例放弃治疗，最终ARPG 143例和ARNG 100例进行了治疗，分别从CR、CRi、PR和治疗失败进行诱导缓解治疗结果对比分析，发现CR和治疗失败在两组间的差异有统计学意义(P<0.05)，而CRi和PR在两组间的差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.4 生存分析 对接受治疗的243例患者进行随访，通过Kaplan-Meier生存分析，ARPG患者中位OS为15个月，ARNG患者中位OS为11个月，通过Log-rank test对生存曲线进行对比分析，两组OS间差异无统计学意义(2=3.335，P>0.05)，见图1。

3 讨论

Auer小体是细胞浆的中一和种针状内容物，可见AML患者原始和较成熟的细胞，它是AML的一种特殊的病理特征，可见于30%～54%的AML患者[5]。电镜显示[6]Auer小体与细胞内的嗜天青颗粒结构电子密度相似，呈层纹状结构，有规律排列；过氧化物酶染色、苏丹黑染色、糖原染色、酸性磷酸酶染色和碱性磷酸酶染色均为阳性，而脂肪酶和核酸染色为阴性，因此，推测Auer小体是由胞浆内嗜天青颗粒融合而成[7]。Jain等[8]认为白血病患者骨髓或外周血涂片中见到Auer小体不但有诊断意义，而且可以排除急性淋巴细胞白血病的诊断，他们的研究结果显示AML患者中占66.3%。本研究中248例入选AML患者中有145例(58.5%)是细胞浆中Auer小体是阳性的，与既往文献接近，毕竟观察Auer小体主观因素很大，再一就是骨髓涂片制作水平也是影响对细胞内容物观察的主要因素，涂片均匀，细胞展开的完全才能更好地观察细胞结构，最后显微镜的亮度对细胞形态的分析也是重要因素，光线太暗，Auer小体容易被其他细胞内容物掩盖，光线太强，会把细胞打透，也观察不到Auer小体。

Billström等[5]认为Auer小体阳性AML患者所占比例与患者年龄呈负相关关系。Hassan等[9]的研究显示Auer小体阳性AML患者的年龄较小且细胞分化较好。本研究以60岁为界限把入组AML患者分为两组，虽然ARPG患者<60岁患者所占比例(82.76%)>ARNG患者(77.67%)，而60岁以上患者(17.24%)小于ARNG患者(22.34%)，但两组患者的年龄差异无统计学意义(P=0.318)。众所周知，白血病常见临床症状出血、贫血和感染，自然是患者体内PLT、HGB/RBC和WBC质和量的变化引起的，本研究中ARPG和ARNG患者PLT、HGB/RBC和WBC间的差异无统计学意义，与两组间出血、贫血和感染症状无统计学差异是一致的。AML患者常会伴有骨骼的疼痛，这是白血病细胞大量增殖引起骨髓腔内压力增高而导致的，骨髓的增生程度越高、白血病细胞所占比例越高，患者肢体疼痛就越明显，本研究两组患者间肢体疼痛和骨髓原始细胞比例的差异均无统计学意义(P>0.05)。在一般临床特点的分析中，本文还分析了两组间性别、既往病史、心血管疾病症状、呼吸系统疾病症状、消化系统疾病症状和神经系统疾病症状的不同，但除了ARPG患者有心血管疾病症状比例低于ARNG患者(P=0.004)而有消化系统疾病症状比例高于ARNG患者(P=0.004)有统计学意义外，其余特点在两组间均无统计学意义，这些差异是否与Auer小体的存在有相关性，还需进一步证实。

实验室检查ARPGARNGZ/2值P值骨髓原始细胞比例(%)0.55±0.220.57±0.25-0.4170.638外周血细胞 WBC∗12.59(4.58,32.88)13.41(2.9,52.94)7 407.5000.914 RBC∗2.4(1.99,2.92)2.36(1.91,2.88)6 951.0000.353 HGB80.81±22.0777.51±21.151.1780.240 PLT∗39(22,59)42(20,76)7 206.5000.639染色体核型预后(例) 预后良好32318.2320.000# 预后中等104875.5240.019# 预后不良9133.0650.080#融合基因(例) AML-ETO39618.0020.000#AML相关突变(例) FLT3-ITD24160.0460.830# FLT3-TKD850.0530.817# NPM115161.4830.023# TET21031.9240.165# CEBPA913.0210.082△ DNMT3A760.1210.728# c-KIT1216.4700.011# EP300740.0020.966△ WT146330.0030.958# IKZF11251.1040.293#FAB分型(例) M2973520.2080.000# M41360.5370.464# M5315222.9120.000#

注：*：采用M(P25,P75)表示；#表示通过普通的2检验；△表示通过连续校正的2检验

表3 诱导缓解治疗情况

图1 ARPG和ARNG患者生存曲线Log-rank分析

Auer小体是AML的独立诊断标准，亦有报道出现于急性混合性白血病[10]；Jain等[8]的研究认为Auer小体阳性AML患者多为FAB分型中的M2和M4，少数为M1和M3，极少数为M5；Hassan等[9]的研究发现Auer小体在M2与M3中的检出率最高，其次为M4与M5，Auer小体的出现是预后较好的重要标志；我国学者白清宇等[11]认为Auer小体的出现在形态学上标志该细胞起源于白血病克隆，在非M3的AML尤其多见于粒系白血病中的M2型，少见于急性单核细胞白血病。从以上文献可见Auer小体易见于M2，而少见于M5，其他急性髓系白血病亚型则报道不一致。本研究AML患者ARPG中有97例(66.90%)为M2型，明显高于APNG中35例(33.98%)为M2型，而ARPG中有31例(21.38%)为M5型，明显低于APNG中52例(50.48%)为M5型，且差异均有统计学意义(P<0.05)，但ARPG与ARNG组患者M4所占比例的差异无统计学意义(P>0.05)。本研究所有患者均通过荧光定量PCR检测AML1-ETO、PML-RARα、CBFβ/MYH11等13种AML相关融合基因，但除AML1-ETO在两组患者中均有较多表达外，其他融合基因表达较少，如果进行统计学分析的话意义较小，所以本研究仅对AML1-ETO在两组患者中进行了对比分析，ARPG患者AML1-ETO阳性比例26.9%(39/145)明显高于ARNG患者5.83%(6/103)，差异有统计学意义(P<0.05)。同样本研究通过采用二代测序方法检测NPM1、FLT3-ITD、FLT3-TKD等53种AML相关基因突变，剔除在两组患者中突变较少的位点，最终本研究对FLT3-ITD、FLT3-TKD、NPM1、TET2、CEBPA、DNMT3A、c-KIT、EP300、WT1和IKZF1在两组患者中发生突变的差异，结果ARPG患者NPM1发生突变比例10.34%(15/145)，低于ARNG患者15.53%(16/103)，而c-KIT突变比例8.28%(12/145)高于ARNG患者0.1%(1/103)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2001年世界卫生组织提出的造血和淋巴系统疾病分型标准中，将伴有AMLl-ETO融合基因的AML定义为一种独立亚型，并认为AMLl-ETO阳性AML往往预后良好，研究表明，AMLl-ETO阳性AML患者的化疗缓解率较高[12]。本研究患者除去ARPG 2例和APNG 3例患者放弃治疗，其余243例均接受正规化疗，诱导化疗后，ARPG患者63.64%(91/143)获得CR，高于ARNG患者48%(48/100)，而治疗失败获得CR患者9.79%(14/143)，低于ARNG患者23%(23/100)，差异均有统计学意义(P<0.05)，与胡忠利等[13]对21例Auer阳性患者和71例Auer阴性患者的初次诱导缓解率发现，Auer小体阳性的AML初次诱导缓解率明显较高的研究结果一致。结合本研究两组AMLl-ETO阳性的差异，与上述文献一致。但两组间获得CRi和PR患者比例的差异无统计学意义(P>0.05)。

与Billström等[5]研究结论Auer小体阳性AML患者多为预后良好和中等核型，而Auer小体阴性患者多为预后不良核型，不完全一致，本研究发现ARPG患者预后良好核型比例22.07%(32/145)，高于ARNG患者2.91%(3/103)，而预后中等核型比例71.72%(104/145)，低于ARNG患者84.47%(87/103)，差异均有统计学意义(P<0.05)，但两组间预后不良核型患者比例的差异无统计学意义(P>0.05)。目前细胞遗传学异常仍是AML进行疾病诊断、预后评分层和治疗方案制定中重要的指标之一，是世界卫生组织和美国国立综合癌症网络对AML分类和预后分层的主要依据，但科学家们逐渐发现，即使具有相同的细胞遗传学异常，AML的治疗效果及长期预后也大不一样，如伴有t(8；21)(q22；q22)遗传学异常的AML曾被认为是一种预后良好的亚型，而随着分子生物学研究的深入，尤其是c-KIT基因突变的发现使得这部分AML的预后被重新划分，即伴有c-KIT基因突变的t(8；21)AML患者疾病复发率高，预后较差[14]。正常由于这个原因，尽管Arber等[15]认为NPM1突变提示相对较好的预后，c-KIT突变的患者预示着更差的预后，再加上新的化疗及靶向的药物的不断出现和化疗方案的持续改进，导致现在Auer小体阳性与阴性患者的预后与20世纪Hassan等[9]的研究结果Auer小体阳性AML患者有较好的预后，及Billström等[5]的研究结果Auer小体阳性AML患者OS要长于Auer小体阴性者不同，本研究结果显示尽管ARPG的OS高于ARNG患者，但两组间的差异无统计学意义(P>0.05)，而与近年来胡忠利等[13]随访了8例Auer阳性与20例Auer阴性患者，发现两者的OS没有明显差异的结论一致。

综上所述，与Auer小体阴性患者相比，Auer小体阳性患者多为FAB分型中AML1-ETO融合基因阳性的AML-M2，少见于AML-M5，常伴有消化系统疾病症状，而少有心血管系统疾病症状，预后良好核型比例较高，但预后中等核型偏低，易伴c-KIT基因突变，而NPM1突变少见，有较高的CR率，但两者的OS差异不明显。