生物锰氧化物聚集体对染料的脱色性能研究*

2020-05-06杨朋坤

河南畜牧兽医 2020年6期

张震，丁涵，杨朋坤

（1.河南牧业经济学院，河南郑州 450046；2.河南省家禽业协会）

纺织染料是一类种类丰富、结构复杂的化学品，通常包括偶氮类、蒽醌类、靛酚、三芳甲烷和杂环类等多种类型。工业废水中残留的纺织染料的去除已经成为水污染治理领域的一个重要研究方向。生物方法处理染料残留的机制是利用生物产生的酶降解染料。现在已经发现的可以降解纺织染料的酶有木质素酶过氧化物酶、偶氮还原酶、锰过氧化物酶、酪氨酸酶和漆酶等。这些酶都是通过对染料特定基团的氧化还原作用对染料进行脱色的。其中研究较多的是漆酶。漆酶是一类可以氧化多种芳香族化合物的多铜氧化酶，其底物广泛，包括芳香族化合物，ABTs，金属离子等。从白腐真菌（P. ostreatus）提取的漆酶粗酶对Remazol Brilliant Blue R（RBBR）蒽醌染料的最大脱色效率可达70%，将酶液固定在藻酸铜珠上可以提高酶的重复利用次数。而真正的工业废水中通常是几种染料混合存在，关于混合染料的脱色报道还不多。最近利用表面展示技术将细菌漆酶锚定在恶臭假单胞菌表面构建成重组菌，重组菌对蒽醌类染料酸性绿25 的最大脱色效率为97%，对偶氮类染料酸性红AR18 的脱色率达到89%。对混合染料的脱色也有同样的效果，而且这种重组菌可以重利用。

锰氧化物是一种具有强氧化性的氧化剂。化学合成的β-MnO2纳米棒在酸性条件下无须过氧化氢即可催化降解碱性桃红染料，常温条件下，pH 值在1 左右时，反应90min后染料溶液脱色率达87%；纳米结构的ε-MnO2可以用于催化分解苯酚；纳米结构的β-MnO2催化降解罗丹明B（Rh B）的降解率为75%；δ-MnO2氧化降解双酚A的去除率即可达到99%。

虽然生物和化学的方法都可以降解染料，但是都有其局限性。生物的方法降解染料一般都是只针对一种染料或一类染料，而且单纯的酶的重复利用性比较差，将酶固定在纳米载体上会导致成本升高。纯粹的化学降解方法成本高，而且降解率较低。

该实验室从畜禽废水中分离得到的一株假单胞菌MYZ68，既可以氧化Mn（II）生成锰氧化物，又具有全细胞漆酶活性，在氧化Mn（II）的同时细菌可以和锰氧化物形成聚集体。该研究利用聚集体同时具有的漆酶氧化活性和锰氧化物的氧化活性及吸附性对复合纺织染料废水进行脱色研究，并检测其重复利用率。

1 材料和方法

1.1 材料

假单胞菌MYZ68 为河南牧业经济学院保存，分离自河南卢氏锰矿场表层土壤。LBB 和ABTs 购买自美国Sigma-Aldrich公司，其他化学试剂为国产分析纯。Lept培养基，30℃，摇床（150 r/min）培养细菌。含锰培养基中Mn（II）的初始浓度为1 mmol/L。染料溶于0.1 mol/L 醋酸钠缓冲液（pH 4.0）配制成10 g/L的母液备用。

1.2 细菌全细胞漆酶活性和锰氧化活性的检测

漆酶的活性测定以ABTS 为底物在25℃下进行。2 mL反应体系包括：100 μL 0.5 mM的ABTS，1.7 mL 0.1 mol/L的乙酸钠缓冲液（pH4.0），100 μL 2 mM 的CuCl2和100μL OD600=1.0 用PBS 重悬的全细胞菌液（收集细胞后，用PBS洗涤3次）。测定420 nm下的吸光度值。1个单位的酶活定义为每分钟氧化1 umol的ABTS所需的酶量。酶活测定及计算方法参照Bourbonnais 等（Bourbonnais and Paice,1990）描述修改进行。

LBB法测定细菌的锰氧化活性：挑取细菌单菌落于培养基中，按照0.5%～1%的接种量转接到含锰的培养基中培养，收集1 mL 菌体（12000 r/min,30 s），弃上清，加入50 μL Hepes（10mM），混匀，按1∶5（V∶V）加入0.04%LBB 溶液，避光反应约10 min。反应后，离心（12000 r/min,30 s），取上清测定吸光值（620 nm）。根据高锰酸钾标准曲线计算锰氧化物浓度（Zhang et al.,2015）。

1.3 染料脱色实验

5 mL 反应体系包括：染料500 μL（终浓度为1g/L），3.5 mL 0.1 mol/L乙酸钠缓冲液，1 mL用PBS重悬的聚集体（收集培养48h的聚集体后，用PBS洗涤3次），反应体系处于25℃。150 r/min摇床中脱色24 h，每1 h取一次样品，在染料的最大吸收波长处用紫外-可见分光光度计测得脱色率。空白对照实验在不加细菌聚集体的相同条件下进行。所有测量均重复三次取平均值。

脱色率公式为：脱色率（%）=（A0-A）/A0100%

A0—染料的初始吸光度值

A—经过漆酶处理后染料的吸光度值

1.4 持续脱色实验

用本实验所用的聚集体在最适条件下处理染料，这称之为第一轮脱色。离心收集第一轮脱色的脱色产物，在同样条件下再脱色染料。这称之为第二轮脱色。然后离心收集第二轮脱色的脱色产物在含Mn（II）的Lept培养基中培养6 h，离心收集聚集体，在最适条件下脱色染料，这称之为第三轮脱色。分别计算三轮脱色实验的脱色率。

2 结果

2.1 细菌MYZ68的全细胞漆酶活性和锰氧化活性

本研究检测了MYZ68在生长过程中全细胞漆酶活性和Mn（II）氧化活性的变化。MYZ68 在含1mmol/L 浓度的LEPT培养基中30℃培养，每4 h取样检测其全细胞漆酶活性和锰氧化物浓度，结果如图1所示。

图1 MYZ68生长过程中的全细胞酶活和锰氧化活性变化曲线

结果显示，MYZ68 在生长12 h 后全细胞漆酶活性达到最高，约45 U/mL，而后随着时间的延长，漆酶活性逐渐降低，在28 h时漆酶活性逐渐稳定，约35 U/Ml。MYZ68形成的锰氧化物浓度在28 h 时达到最高，大约95%以上的Mn（II）已经被氧化为Mn（IV）。漆酶是形成锰氧化物聚集体的关键酶，与游离的漆酶相比，存在于锰氧化物聚集体中的漆酶活性保留的时间更长。

2.2 聚集体对染料进行脱色的影响因子分析

利用聚集体对四种染料进行了脱色研究，分别是偶氮类染料酸性红18（Acid Red 18，AR18）和活性黑5（Reactive Black 5，RB5）、芳基甲烷类染料碱性黄2（Basic Yellow 2，BY2）以及蒽醌类染料酸性绿25（Acid Green 25，AG25）。分别检测了时间、pH值、温度和金属离子对聚集体降解这四种染料的影响。

结果显示，聚集体在10 min时对各种染料的脱色即达到一定程度，在40 min时达到最大脱色效果，1 h左右达到稳定状态。聚集体对偶氮类染料的脱色性能最好，脱色率可达95%以上。对芳基甲烷类染料碱性黄的脱色效果最差，只有70%左右。

脱色体系的pH值在2.0～4.0之间时，聚集体对四种染料的脱色绿最高，最高可达99%。在碱性环境中，聚集体对染料的脱色率大幅降低。其中偶氮类化合物的脱色率降至55%左右，碱性黄的脱色率最低，只有40%左右。

在25～45 ℃的温度下聚集体对各种染料的脱色率最高。漆酶的最适温度在30 ℃左右，这个温度范围漆酶的活性较高，菌体的各种吸附性蛋白也有较高的活性，因此脱色作用较强。在45 ℃时游离酶的活性逐步降低，但是在聚集体中由于锰氧化物和菌体的保护，漆酶仍然能够保持一定的活性，所以聚集体对染料的脱色率也维持在较高水平。随着温度的升高，脱色率逐渐下降，到85 ℃时偶氮类染料的脱色率约75%，AG25 和BY2 的脱色降至65%左右。在85℃时，酶的活性已经丧失，细菌菌体也极易裂解。

综上所述，聚集体对染料进行脱色的最优条件为pH值3.0，25℃，在1h内可以完成对染料的脱色，聚集体对偶氮类染料AR18 和RB5 的脱色效果最好，脱色率可达98%，而对蒽醌类染料AG25 的脱色效果次之，可达80%，对芳基甲烷类染料BY2的脱色效果最差，但是也有75%的脱色率。经过聚集体的脱色作用，含染料的水基本上可以达到清澈的效果。

2.3 聚集体对复合染料的脱色

实际生活中的染料废水经常含有不止一种染料，因此检测了聚集体对多种染料混合体系的脱色率。在最优脱色体系中，分别加入总染料含量为1g/L的两种或三种染料的混合物，测定所加入染料的脱色率。

图2 聚集体对两种染料混合体系的脱色作用

结果显示，聚集体可以完成对含有两种染料的水体的脱色，但是其脱色作用相对于单色染料作用过程稍慢，需要1h以上才能达到效果（图2）。

2.4 聚集体对染料的循环降解

脱色材料的重复利用和可再生性是评价材料性能的重要标准，本文用三轮脱色试验验证了聚集体的重复利用和再生性。

结果显示，经过一次脱色试验后，直接用于脱色试验的效果较差，脱色率低于第一轮，但是仍有初始能力的90%，经过简单的培养后，聚集体恢复了脱色能力，在第三轮脱色试验中的脱色率与第一轮相当。说明该研究所用的MYZ68所形成的聚集体具有良好的再生性和重复利用能力。

3 讨论

锰氧化物作为一种纳米颗粒材料，具有很高的氧化活性，可以氧化多种有机化合物，并可以吸附多种金属和有机物。尽管化学合成的锰氧化物可以完全氧化有机物，但是都需要极高的温度（＞300℃）和严格的pH值条件，或需要其他辅助因素。而这些严苛的条件在实际的应用中都是极难完全符合的。特别是在大规模处理污水样品时，简单、快速、抗逆、廉价是一种良好的可实际利用的降解方法所必须具备的条件。

漆酶是一种多铜氧化酶，具有强氧化性，可以降解多种有机化合物，底物十分广泛。漆酶对染料进行脱色的研究很多，但是多数研究表明，漆酶对染料的脱色并不充分，这在应用中就会造成二次污染，从而限制了漆酶在实际生产中的应用。因此，欲在一个温和的环境中彻底去除纺织染料的危害，仅靠漆酶或锰氧化物的氧化等单一的方法难以达到目的。

锰氧化细菌在氧化Mn（II）的过程中可以与锰氧化物形成规则的聚集体。假单胞菌MYZ68在氧化Mn（II）并形成锰氧化物的过程中，与锰氧化物裹挟在一起，而后更多的细菌再吸附在这个混合物上，从而形成球型聚集体。在聚集体中MYZ68 的全细胞漆酶活性可以存留更长时间，漆酶的降解速度明显下降。

在锰氧化物聚集体中，细菌的漆酶和锰氧化物都有极强的氧化活性。同时，纳米级的锰氧化物和细菌都可以给漆酶提供一个相对稳定的微环境和支撑，使其在一定程度上免受外界因素的干扰，可以在较长时间内保持活性，并在pH 值3.0～5.0 的范围内都保持一个相对较高的活性。这比游离的漆酶对pH 的要求要低很多（Shao et al.,2009）。因此，锰氧化物和细菌的混合体系可以在一个相对中性的条件下对纺织染料进行脱色。漆酶对温度也比较敏感，锰氧化物和细菌给漆酶提供的微环境和支撑使漆酶对温度的敏感性有所降低，在45℃时使漆酶依然具有相当的活性。而锰氧化物的降解反应则需要较高的温度，温度越高越有利于其对染料的脱色，所以在高温时，聚集体也依然对纺织染料表现了相当的脱色作用。

聚集体可以迅速对燃料进行脱色，在最适条件下10 min时对偶氮类染料的脱色率即可达到95%以上，40 min时对蒽醌和芳基甲烷类染料的脱色率可以达到75%以上。实验证实，聚集体这种复合材料极大地克服了纯酶或细菌、锰氧化物的缺点，同时揉合了二者的优点，对染料的脱色展现出快速和条件温和的特点。

金属离子是染料中常用的助剂，对漆酶活性的影响也很大，很多金属离子在低浓度时就可以降低漆酶的酶活，而在本实验中，多数的金属离子在低浓度时对聚集体脱色作用的影响是不显著的，这可能是细胞和锰氧化物对漆酶或细菌有一定的保护作用，可以降低金属离子的伤害。同时，MYZ68 形成的锰氧化物与菌体裹挟在一起，也对漆酶的活性有一定的保护作用，避免外界条件的侵扰。因此，本研究中构建的这一新型脱色材料对外界环境更有抵抗力，可以抵抗较高的温度和各种金属离子的影响。

锰氧化物聚集体具有制备简单、再生过程简单的特点，只需要简单的培养就可以制备。这种材料适合大规模的制备，以用于大量处理水环境中的染料。而且聚集体的重复利用性和可再生性良好，使用过的聚集体只要经过简单的培养就可以恢复活性，很适合大规模连续处理水中的染料。漆酶不仅可以对染料进行脱色，还可以氧化其他多种物质，可以用于有机物降解等领域，因此锰氧化物聚集体不仅仅是一种染料脱色材料，还有很大的潜力应用于废水综合处理领域。