凋亡调节蛋白XIAP与Omi/HtrA2在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及其与患者预后的关系

卞 乐，艾丽梅

(锦州医科大学附属第一医院 血液二科, 辽宁 锦州 121000)

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一类，呈高发病和高度侵袭性，约占成人NHL的30%，且我国DLBCL的发病人数也在逐年增多[1]，经积极的治疗少部分患者可有较好预后[2-3]。凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)是一类抑制细胞凋亡的家族，国内外研究表明生物体细胞的凋亡失去控制是导致肿瘤的发生的机制之一[4]。IAPs家族中作用较强的成员X染色体连锁凋亡抑制因子(X-linked inhibitor of ap-optosis protein，XIAP)，主要通过抑制半胱酸天冬氨酸蛋白酶分子(caspase)的活性来抑制细胞凋亡[5]。线粒体产生的一种特殊的丝氨酸蛋白酶Omi/HtrA2，可阻止XIAP和caspase的这种结合而促进细胞的凋亡[6-8]，XIAP和Omi/HtrA2在细胞中的特异性表达与机体恶性病的发生发展紧密相关，但国内外对这两种蛋白在DLBCL中的表达研究甚少。本研究采用免疫组织化学的方法检测XIAP与Omi/HtrA2在DLBCL中的表达情况，并分析二者的相关性，通过随访分析两种蛋白与DLBCL患者的预后，为DLBCL的靶向治疗和预后评估提供新的方向。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选取2017年1月至2018年12月间于锦州医科大学附属第一医院门诊或住院治疗的59例DLBCL患者病理切片为实验组。参照2013版《中国弥漫大B细胞淋巴瘤诊断和治疗指南》及2011版《弥漫大B细胞淋巴瘤临床路径》，以活检病理学和免疫组织化学分析明确诊断，其中发病年龄25～79岁，中位年龄为62岁，男性32例，女性27例，病理类型：生发中心(GCB)型28例，非生发中心(nGCB)型31例，Ann Arbor-Cotswolds分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期9例，Ⅲ期19例，Ⅳ期15例。同时选取同期在锦州医科大学附属第一医院门诊或住院治疗的30例淋巴结反应增生(RCL)患者病理切片作为对照组。

1.2 相关试剂 XIAP兔抗人多克隆抗体(稀释浓度1∶200)、Omi/HtrA2兔抗人多克隆抗体(稀释浓度1∶100)购于北京博奥森生物技术有限公司，兔SP试剂盒和DAB显色试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 研究方法 采用免疫组织化学法将石蜡切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡和水化后，将切片于蒸馏水中浸泡1 min，用PBS冲洗5 min，共冲洗3次，在高压锅中用柠檬酸钠缓冲液进行抗原修复，自然冷却至室温后用50 μl的过氧化物酶阻断，室温孵育10 min，PBS冲洗5 min，滴加封闭用正常山羊血清50 μl，室温孵育20 min，甩去多余的液体，擦干切片，勿洗，滴加一抗，4 ℃湿盒过夜，次日取出切片，PBS缓冲液冲洗5 min，滴加生物素标记山羊抗兔IgG聚合物50 μl，室温孵育15 min，PBS冲洗5 min，用50 μl辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育20 min，在光学显微镜下用新鲜配制的DAB溶液显色5 s，苏木素染色，1%盐酸乙醇分化后复染，最后经逆浓度乙醇脱水，二甲苯透明化后用中性树脂固封。

1.4 结果判定 在光学显微镜下应用半定量积分的方法，即根据每张病理切片染色的深浅程度和蛋白阳性表达的细胞比例来计算积分。切片染色程度：无着色即0分，浅黄色即1分，棕黄色记2分，深棕色记3分。蛋白阳性表达的细胞比例：无阳性表达记0分，阳性表达小于25%记1分，阳性表达在25%～50%记2分，阳性表达大于50%记3分。最后的得分是将每张病理切片染色程度得分和蛋白阳性表达的细胞比例得分两两相乘。结果判定如下：阴性(-)： 0～1 分；弱阳性(+)：2～3 分；中等阳性(++)：4～6 分；强阳性(+++)：6分以上。观察结果由至少2名经验丰富的病理科医师判定，若得出的结果冲突，可进行3次观察与计算，得出最终结论。

1.5 统计学方法 所有数据采用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计数资料组间比较应用χ2检验；应用Spearman等级相关分析XIAP和Omi/HtrA2蛋白表达的相关性；应用Kaplan-meier法分析XIAP和Omi/HtrA2的表达与DLBCL患者的预后；应用COX比例风险模型计算各临床因素的风险比(hazard radio，HR)和95%可信区间(confidence interval，CI)来评估对疾病预后不良的影响程度，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 XIAP在DLBCL和RHL组织中的表达 XIAP在DLBCL组织中主要在细胞质中表达 ，为棕黄色颗粒状，形态、大小不等(图1)，阳性率为61.02%(36/59)，在RHL组织中的阳性表达为36.67%(11/30)(图2)，差异有统计学意义(P=0.030)，见表1。

表1 DLBCL和RHL组织中XIAP表达

注：χ2=4.732，P=0.030

2.2 Omi/HtrA2在DLBCL和RHL组织中的表达 Omi/HtrA2在DLBCL组织中主要表达在细胞质，为形态大小不均的棕黄色颗粒状(图3)，阳性率为52.54%(31/59)，在RHL组织中可见少量棕黄色颗粒(图4)，阳性率为30.00%(9/30)，两组差异有统计学意义(P=0.043)，见表2。

图1 XIAP在DLBCL组中的表达(SP×400) 图2 XIAP在RHL组中的表达(SP×400)

图3 Omi/HtrA2在DLBCL组中的表达(SP×400) 图4 Omi/HtrA2在RHL组中的表达(SP×400)

表2 DLBCL和RHL组织中Omi/HtrA2表达

注：χ2=4.084，P=0.043

2.3 XIAP和Omi/HtrA2表达的相关性分析 采用Spearman等级相关分析发现，二者的表达呈负相关(P=0.018)，见表3。

表3 XIAP与Omi/HtrA2表达的相关性(例)

2.4 XIAP蛋白与DLBCL临床病理学特征的关系 XIAP的阳性表达与DLBCL患者的临床分期(P=0.012)、病理类型(P=0.012)、乳酸脱氨酶(LDH)水平(P=0.026)、淋巴瘤国际预后指数(IPI)评分(P=0.043)相关，与患者的性别、年龄、有无结外受累、症状分组无关(P>0.05)，见表4。

2.5 Omi/HtrA2蛋白与DLBCL临床病理学特征的关系 Omi/HtrA2的阳性表达与DLBCL患者的临床分期(P=0.033)、病理类型(P=0.013)、LDH水平(P=0.010)、IPI评分(P=0.019)相关，与性别、年龄、症状分组、有无结外受累无关(P>0.05)，见表5。

2.6 生存分析 本研究对59例DLBCL患者进行了电话随访，截止到2019年12月31日，随访时间为40个月，期间有2例患者失访，失访率为3.38%，其中死亡27例，复发31例，1年总生存率(OS)84.75%，2年OS 64.41%，3年OS 55.56%；1年无进展生存率(PFS)83.05%，2年PFS 59.32%，3年PFS 47.00%。

2.6.1 XIAP蛋白的表达与DLBCL预后的关系 生存分析显示，XIAP阳性表达的患者3年OS和3年PFS与阴性表达的患者比较差异有统计学意义(P=0.007，P=0.008)，见图5～6。

2.6.2 Omi/HtrA2蛋白的表达与DLBCL预后的关系 生存曲线显示，Omi/HtrA2阳性表达的患者3年OS和3年PFS与阴性表达的患者比较差异无统计学意义(P=0.122，P=0.385)，见图7～8。

2.6.3 XIAP和Omi/HtrA2共同表达与DLBCL的预后 由生存曲线可看出，XIAP和Omi/HtrA2双阳性表达与双阴性表达的患者3年OS和3年PFS差异无统计学意义(P=0.466，P=0.261)，但从曲线中可以看出XIAP单阳性表达的患者无论Omi/HtrA2是否为阳性，患者的3年OS和3年PFS差异均有统计学意义，见图9～10。

表5 Omi/HtrA2与DLBCL临床病理学特征的关系[例(%)]

图5 XIAP蛋白的OS曲线 图6 XIAP蛋白的PFS曲线

图7 Omi/HtrA2蛋白的OS曲线 图8 Omi/HtrA2蛋白的PFS曲线

图9 XIAP和Omi/HtrA2共同表达的OS曲线 图10 XIAP和Omi/HtrA2共同表达的PFS曲线

2.6.4 临床指标单因素及多因素预后分析 采用Kaplan-meier法对各个临床指标进行分析，包括患者性别、年龄、淋巴瘤分期、LDH水平、症状分组、 病理类型和有无结外受累等。结果显示：患者的性别、年龄、症状分组、结外受累与患者预后无关(P>0.05)。患者淋巴瘤分期为Ⅲ～Ⅳ(P=0.022)、LDH>250 U/L(P=0.015)、病理类型为nGCB(P=0.034)、IPI为中高危(P=0.001)是DLBCL患者3年OS的预后不良因素，患者淋巴瘤分期为Ⅲ～Ⅳ(P=0.017)、LDH>250 U/L(P=0.041)、病理类型为nGCB(P=0.026)、IPI为中高危(P=0.018)是DLBCL患者3年PFS的预后不良因素。

采用COX回归多风险比例模型分析得出XIAP的阳性表达是影响DLBCL患者3年OS(HR=7.527，95%CI为1.527～37.049，P=0.013)和3年PFS(HR=0.291，95%CI为0.125～0.677，P=0.004)的独立预后不良因素，见表6～7。

表6 单因素分析DLBCL的3年OS和3年PFS

表7 DLBCL的3年OS和3年PFS多因素分析

3 讨 论

细胞凋亡，又称程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD)，是多生物体细胞经特定基因的调控自动发生死亡的过程，可有效维持人体自身平稳，细胞凋亡失去控制是机体产生肿瘤的机制之一[9-10]。

XIAP定位于染色体Xq25位点，具有两个特征性的分子结构域，一是位于XIAP氨基端的3个杆状凋亡蛋白抑制重复序列(BIR)，IAPs家族主要依赖BIR结构域发挥抑制细胞凋亡的作用，二是位于XIAP羧基端的1个锌指结构环(RING)，其环状结构有泛素蛋白连接酶的作用。XIAP抗细胞凋亡的作用主要与抑制caspase[5, 11]、激活核因子κB(NF-κB)途径和参与多条信号通路有关[12]。国内外大量研究显示XIAP在胃癌[13]、乳腺癌[14]、卵巢癌[15]、肺癌[16]等恶性病的组织均呈现特异性表达。

Omi/HtrA2是一种主要分布在线粒体的促凋亡蛋白，在凋亡信号的作用下Omi/HtrA2可转化为具有促细胞凋亡的成熟因子，由线粒体释放至胞内，通过依赖caspase和非依赖caspase两条通路促进细胞凋亡[17]。在依赖caspase途径中，成熟的Omi/HtrA2氨基端可直接与IAPs氨基端的BIR特异性结合，降解IAPs，恢复caspase的活性从而解除对细胞凋亡的抑制，也可通过利用自身蛋白酶的活化促进凋亡。有研究显示，Omi/HtrA2在白血病、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤疾病中以多种的途径促进细胞的凋亡[18-20]。

本实验显示，XIAP和Omi/HtrA2在DLBCL中呈高表达，在RHL中为低表达甚至不表达，二者的阳性表达与DLBCL的临床分期、病理类型、LDH水平、IPI评分有关(P<0.05)，与性别、年龄、症状分组、结外受累无关(P>0.05)。XIAP和Omi/HtrA2表达为负相关，说明XIAP和Omi/HtrA2在DLBCL中作用相互抑制。

此外Kaplan-meier曲线显示XIAP与DLBCL患者预后相关，而Omi/HtrA2与患者预后无关，不能作为判断预后的指标，但通过生存曲线得出Omi/HtrA2阳性率高的患者比阳性率低的患者预后好，可能是高表达的Omi/HtrA2促进了恶性细胞的凋亡，减少了肿瘤细胞的转移和复发从而使患者的生存期延长。

综上所述，XIAP和Omi/HtrA2在DLBCL中同为高表达，表达为负相关性，二者作用相互拮抗，检测XIAP和Omi/HtrA2有助于DLBCL的临床诊断和靶向治疗，XIAP与DLBCL的预后相关，有望成为评估预后的新指标。