上海郊区小麦赤霉病菌多菌灵抗性群体动态的研究

张 穗，陈 伟，王 东，朱洪彩， 程欢欢

(1上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海201106；2 山东理工大学，淄博255000,；3贵州安顺学院,安顺561000)

小麦赤霉病(Gibberellazeae)是世界重要的小麦病害之一，中流行年份可造成产量损失5%—15%，大流行年份达10%—40%，严重威胁小麦的产量和品质。在我国，小麦赤霉病分布范围较广泛，据估计，我国发生赤霉病的麦区面积近667万hm2，占全国小麦总种植面积的14[1-2]。1972年以来，我国防治小麦赤霉病发生的主要手段是在小麦扬花期喷洒化学杀菌剂多菌灵及其同类药剂[3]。但是，长期单一的化学防治，导致赤霉病菌对多菌灵的抗药性日趋严重[4-5]。

王建新等[6]研究发现，江苏、安徽、浙江、湖北、山东、河南等地小麦赤霉病菌群体中均存在抗药性。上海地区长期采用以多菌灵为主的化学防治小麦赤霉病技术，近年来防治效果呈明显下降趋势[7]。 本研究通过研究小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性，旨在为本地区建立科学合理的小麦赤霉病防治技术体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株的分离培养和供试药剂

供试菌株：2013—2015年分别从上海郊区浦东、金山、青浦、崇明、嘉定、宝山、奉贤和松江8个区采集小麦赤霉病穗标本，取病粒置于PDA平板上，25 ℃培养3—5 d，长出玫红色菌落后进行镜检鉴定，单孢分离纯化后备用。

高抗多菌灵的赤霉菌株H：南京农业大学周明国教授提供。

供试药剂：98%多菌灵原粉(上海悦联化工有限公司生产)。

1.2 含药培养基的制作[6]

含药培养基的制作：称取99%的氯霉素0.3 g，溶解于3 000 ml PDA培养基中，配成含100 μgmL氯霉素的PDA，分装至400 mL的广口瓶中，每瓶300 ml，121 ℃灭菌30 min。根据各处理所需多菌灵母液的量，用移液枪吸取并加入经高压灭菌后的PDA培养基中，摇晃均匀，而后倒入无菌培养皿中即制得含药培养基。

1.3 分离菌对多菌灵抗药性水平测定[8]

1)敏感菌株和抗药菌株的鉴定 先将所有采集的病穗标本放入4 ℃冰箱保存7—10 d，然后进行单孢分离。单孢分离菌分别移至含5 μgmL多菌灵的PDA平板上，25 ℃培养7 d。凡在含5 μgmL多菌灵PDA平板上不能够长出菌落的分离菌为多菌灵敏感菌；凡能够长出菌落的分离菌为多菌灵抗性菌。

2)敏感菌株EC50的测定 在含多菌灵0(CK)、0.025 μgmL、0.05 μgmL、0.1 μgmL、0.2 μgmL、0.4 μgmL、0.8 μgmL、1.6 μgmL、2.5 μgmL的共9个浓度梯度处理的PDA平板上分别测定分离菌的菌丝生长抑制活性。每处理重复3皿，25 ℃培养3 d，待对照菌落长满整个平板时，测量各处理的菌落直径，并求出各分离菌对多菌灵的有效中浓度(EC50)[3，12]。

3)抗药菌株EC50的测定 在含多菌灵0(CK)、1.25 μgmL、2.5 μgmL、5 μgmL、10 μgmL、20 μgmL、40 μgmL共7个浓度梯度的PDA平板上分别测定分离菌的菌丝生长抑制活性。每处理重复3皿，25 ℃培养3 d，待对照菌落长满整个平板时，测量各处理的菌落直径，并求出各分离菌对多菌灵的有效中浓度(EC50)。

根据小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性的划分标准[5]：敏感菌株在含5 μgmL多菌灵的培养基上完全不能生长；中抗菌株在该培养基上正常生长，但在含50 μgmL多菌灵的培养基上完全不能生长；高抗菌株在含50gmL多菌灵的培养基上能够生长，但是在100μgmL的培养基上完全不能生长；超高抗菌株在含100 μgmL多菌灵的培养基上仍能生长。抗性倍数=抗性菌株EC50敏菌株EC50。按抗药性倍数(RR)的高低进行分级：敏感(RR≤5.0)、低水平抗性(5.0100.0)。

2 结果与分析

2.1 2013—2015年上海郊区小麦赤霉病菌多菌灵敏感性和抗药性种群数量及其分布情况

经分离和鉴定，2013—2015年来自上海郊区8个区(崇明、金山、奉贤、松江、宝山、嘉定、青浦、浦东)的小麦赤霉病菌(Fusariumspp.)分离菌株共计233株，其中对多菌灵表现敏感的菌株207株，占总菌株数的88.84%；抗药性菌株26株，占总菌株数的11.16%，且均属于超高抗药菌株(表1)。

表1 2013—2015年上海郊区小麦赤霉病菌对多菌灵敏感性菌株和抗药性菌株及其分布情况

注：各区不同年份小麦赤霉病标本的数量不同，表中数据均为各区连续3年分离菌的菌株总数。**为平均占比

从分布上看，多菌灵抗药菌群在上海郊区的分布很不均衡。除奉贤区未分离到抗药菌株外，金山和崇明的抗性菌株出现的平均频率较低，分别为4.55%和8.22%；其次是浦东和青浦，平均频率分别为10.91%和12.50%；松江、宝山和嘉定抗性菌株出现的平均频率较高，分别为20%、27.27%和28.57%(表1)。

按照对多菌灵抗药性病菌占群体的15%—18%，赤霉病即为大流行的标准[9],2013—2015年松江、宝山和嘉定区的小麦赤霉病均达到了大流行级别。

表2 2013—2015年上海郊区部分小麦赤霉病菌对多菌灵敏感性的测定

2.2 2013—2015年上海郊区小麦赤霉病菌多菌灵抗药种群的抗药水平

室内毒力测定的结果表明，上海郊区小麦赤霉病菌对多菌灵敏感菌株的EC50在同一年份中各区之间差异不大，但不同年份之间明显不同(表2)。2013、2014、2015年分离菌对多菌灵敏感菌株的平均EC50值依次为(0.463 1±0.033 7) μgmL、(0.251 6±0.038 4) μgmL、(0.130 9±0.013 8) μgmL，呈逐年下降趋势。

上海郊区小麦赤霉病菌对多菌灵抗药菌株的EC50在同一年份中各区之间差异不大，但不同年份之间明显不同(表3)。2013年和2014年抗性菌株的EC50平均值分别为(11.162 3±1.413 7) μgmL和(12.303 4±0.626 3) μgmL，两者之间差异不大，但2015年抗性菌株的EC50平均值达到(20.530 1±1.823 0) μgmL，较前两年抗性水平明显升高。2013—2015年，3年敏感菌株的EC50平均值为(0.276 3±0.018 5) μgmL，平均发生频率为90.29%；抗性菌株的EC50平均值为(17.681 5±1.477 3) μgmL；超高抗性菌株出现的频率依次为5.13%、11.61%和15.38%，呈逐年上升趋势(表3、表4)。2013、2014、2015年上海郊区小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药水平逐年上升，其抗性倍数分别为23.00、46.14和 156.84。2015年由前两年的中等水平抗性急剧上升为高水平抗性(表4)。

表3 2013—2015年上海郊区部分小麦赤霉病菌对多菌灵抗药性的测定

表4 2013—2015年海郊区小麦赤霉病菌多菌灵抗药种群的抗性水平

2.3 不同小麦赤霉病菌分离菌株对多菌灵抗性的遗传稳定性

对2013来年自同一病穗的4株禾谷镰孢分离菌进行室内毒力测定的结果表明，这些分离菌对多菌灵的EC50值与赤霉菌株H的EC50值均比较接近，在(8.586 2±2.564 6)—(14.849 1±1.665 7) μgmL，抗性比值在0.88—1.51。表明上海郊区分离的小麦赤霉病菌抗药菌株的抗性较高且具有群体遗传的稳定性(表5)。

表5 2013年上海郊区同一病穗不同小麦赤霉病分离菌株对多菌灵的抗性测定

3 讨论与结论

据报道，1999—2001年上海郊区小麦赤霉病菌多菌灵抗性菌群出现的频率较低，为3.00%—6.03%[10]。当抗药菌株达到10%时，多菌灵的防治效果将下降至60%[2]。本研究结果表明， 2014和2015年该地区赤霉病菌多菌灵抗性菌株出现的频率明显增高，分别达到了11.61%和15.38%(表4)，这与近年来上海郊区小麦赤霉病发生严重、麦田多菌灵防治效果急剧下降的情况相吻合[2,7，12]，表明病菌多菌灵抗性菌群数量的增加和抗性水平的升高是该地区小麦赤霉病发生日趋严重的原因之一。

在上海各区之间多菌灵抗药菌群的分布很不均衡。青浦、松江、宝山和嘉定区的大部分边界与小麦赤霉病菌的多菌灵抗性水平高的江苏毗邻[11]，其抗药菌群均在10%以上,这些抗药菌群是否来自江苏需进一步研究(表1)。

自2013年起，上海郊区在麦田停止使用多菌灵，并大面积推广秸秆还田耕作制度。本研究中，2013年、2014年、2015年上海郊区小麦赤霉病菌对多菌灵敏感的种群平均占比达到了90.29%，EC50值呈逐年下降趋势。没有了药剂选择压力，分离菌的敏感性增强，这与2013年起麦田停止使用多菌灵存在明显的关联。多菌灵是防治小麦赤霉病的特效药，耐雨水冲刷，且价格低廉[1]，该药剂今后能否继续在上海郊区使用还需进一步监测赤霉病菌多菌灵抗药性菌群的占比、分布及其抗性水平等的变化情况。

尽管上海郊区小麦赤霉病菌多菌灵抗药种群的平均占比只有11.16%，但其EC50值呈逐年上升趋势(表1，表3，表4)，且与2013年起大面积推广秸秆还田呈明显的正相关性。耕作制度的改变会导致农田生态系统发生一系列的变化。秸秆全量还田，若田间处理不彻底会使田间的秸秆量增大，从而给赤霉病菌提供了充足的存活条件，也为小麦赤霉病的发生提供了必要的基础条件。这些现象均应引起农业生产部门的高度重视，加强赤霉病敏感菌群和抗性菌群动态变化的监测与研究，制定科学合理防控技术体系，切实控制这一病害的发生与为害。

致谢：上海市农业技术推广服务中心，浦东新区、金山、青浦、宝山、嘉定、松江、崇明、青浦、奉贤农业技术推广中心植保部门为本研究提供了小麦赤霉病样本材料，在此一并感谢！