甜瓜种子细菌性果斑病菌PCR检测方法的研究

李菊芬，林 涛，马国斌

(上海市农业科学院设施园艺研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海 201106)

细菌性果斑病(Bacteiral fruit blotch，简称BFB)是一种严重危害葫芦科植物的世界性病害，其病原为西瓜嗜酸菌(Acidovorascitrulli)[1]，是一种活体营养型细菌，属于革兰氏染色阴性菌。近些年，随着我国瓜类作物种植规模的不断扩大，果斑病时有发生，曾给部分瓜类产区造成过较大损失。该病已被列为我国对内、对外的植物检疫性病害。瓜类细菌性果斑病为典型的种传细菌性病害[2]，建立一套快速、简便、灵敏的检测方法是当务之急。目前，随着PCR技术的广泛应用，国内外已有许多应用PCR技术检测西瓜、甜瓜种子细菌性果斑病菌的相关报道[3-5]。在传统PCR的基础上，免疫富集PCR[6-7]、免疫磁性分离PCR[8-9]、实时荧光定量PCR[10-13]等方法的应用大大提高了检测的灵敏度，但这些方法操作程序复杂、前期准备工作量大、所需仪器、试剂较为昂贵，不适合一般实验室进行快速检测。本研究在传统PCR技术的基础上，对检测方法进行筛选优化，以期形成一套简单实用，并能在甜瓜种子实际生产中广泛应用的果斑病菌快速检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甜瓜(CucumismeloL.)种子：新疆繁育的自然携带瓜类细菌性果斑病菌的甜瓜种子。供试菌株：由中国农业科学院郑州果树研究所提供的细菌性果斑病标准菌株(Acidovorasavenaesubsp.citrulli，简称Ac)。

1.2 试剂与仪器

普通PCR所需试剂均购于天根生化科技(北京)有限公司。PCR仪为BIO-Rad T100TMThermal Cycler。实时荧光定量PCR采用日本TaKaRa公司的SYBR green荧光染料，仪器为Bio-Rad CFX96TMReal-Time PCR System。使用核算蛋白检测仪(Bio-Rad)测定OD600 nm值。

1.3 引物筛选

选用3对特异引物BX-L1BX-S-R2[4]、HB2F2HB2R2[5]和SEQID4mSEQID5[3]分别进行PCR和实时荧光定量PCR检测，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列及PCR反应条件(略有改动)详见表1。

PCR反应体系(25 μL)：10×buffer 2.5 μL，MgCl22 mmolL，dNTPs 0.2 mmolL，Taq DNA 聚合酶 1 U，正反向引物各0.2 μmolL，模板为1 μL种子提取液，无菌三蒸水补齐。以标准Ac菌株为模板作为阳性对照，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后观察并拍照。

表1 检测细菌性果斑病菌的3对特异引物及PCR扩增条件

实时荧光定量PCR反应体系按照TaKaRa SYBR©Premix Ex TaqTM说明书进行，扩增程序采用Bio-Rad CFX实时荧光定量PCR仪默认程序，即95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s， 40个循环；每个循环结束时收集荧光信号。

Acidovorasavenaesubsp.Citrulli菌株接种在液体KB培养基[14]中，28℃、220rmin振荡培养过夜，离心收集菌体，加入1mL无菌水至悬浮状态，根据测得的OD600 nm值，用无菌水分别配成1×107CFUmL、1×106CFUmL、1×105CFUmL、1×104CFUmL、1×103CFUmL、1×102CFUmL 6个浓度梯度的菌悬液。以不同浓度的菌悬液为模板进行实时荧光定量PCR检测，根据Ct值绘制每对特异引物的标准曲线。试验重复3次。

1.4 种子的不同处理方式

分别取带菌种子100粒，进行以下3种处理。处理A：完整种子直接放入灭菌三角瓶中。处理B：种子去壳后，将种壳和种仁一起放入灭菌三角瓶中。处理C：将种子放入灭菌研钵中研磨至粉碎后，移入灭菌三角瓶中。分别向三角瓶中加入10mL灭菌双蒸水，于28℃、220rmin摇培12h，取1 μL提取液作为PCR模板，以标准Ac菌株为模板作为阳性对照，分别进行PCR和实时荧光定量PCR检测。各处理重复3次。

1.5 不同的提取液处理

分别取带菌种子100粒放入灭菌三角瓶中，进行以下不同处理。处理a：加入10mL灭菌双蒸水。处理b：加入10mL 磷酸缓冲液(PBS Buffer；137 mmolL NaCl，2.7 mmolL KCl，10 mmolL Na2HPO4∶2H2O，2mmolL KH2PO4)。处理c：加入10mL KB液体培养基。将三角瓶于28℃、220rmin摇培12h，取1 μL提取液作为PCR模板，以标准Ac菌株为模板作为阳性对照，分别进行PCR和实时荧光定量PCR检测。各处理重复3次。

1.6 不同的提取时间处理

取带菌种子100粒放入灭菌三角瓶中，加入10mL灭菌双蒸水，于28℃、220rmin分别振荡培养3 h、6 h、12 h、24h，取1 μL提取液作为PCR模板，以标准Ac菌株为模板作为阳性对照，分别进行PCR和实时荧光定量PCR检测。各处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 不同引物对PCR和实时荧光定量PCR检测的影响

普通PCR扩增结果表明(图1)，3对特异引物均能扩出各自的特异条带，均可用于检测甜瓜种子携带的果斑病菌。但经多次重复试验综合比较发现：引物HB2F2HB2R2的扩增产物易形成二聚体；引物SEQID4mSEQID5扩增的特异条带亮度较弱；引物BX-L1BX-S-R2的扩增产物不易形成二聚体，且条带较亮，效果相对较佳，因此后续试验的普通PCR扩增均采用此引物。

以1×102—1×107CFUmL 6个浓度梯度的标准菌株菌悬液为模板，分别用3对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，根据Ct值绘制标准曲线。结果表明，引物SEQID4mSEQID5在进行标准菌液的实时荧光定量PCR时，检测到的Ct值与相应菌液浓度的对数值呈较好的线性相关(R2=0.9917)(图2)，而且PCR产物的特异性好，熔解曲线显示产物只有特异性的一个峰(图3)。对引物HB2F2HB2R2和引物BX-L1BX-S-R2的实时荧光定量PCR反应产物进行熔解曲线分析，未获得特异性单峰，且Ct值与菌液浓度的对数值没有很好的线性相关。综上结果，引物SEQID4mSEQID5适合用于Ac的菌落实时荧光定量PCR检测，因此后续试验实时荧光定量PCR均采用该引物。

2.2 不同种子处理方式对PCR和实时荧光定量PCR检测的影响

带菌甜瓜种子经过3种不同方式处理后，其PCR检测结果也有所不同。由图4可以看出，以处理C为模板进行PCR扩增，没有扩增出特异条带(279bp)。而处理A和处理B均能扩增出目的条带，且条带亮度差异不明显，处理A较B稍亮。但处理A无需研磨或去壳，操作简便。综上比较可知,处理A，即以完整带菌种子直接加水摇培后得到的提取液进行PCR扩增，效果相对较佳。

实时荧光定量PCR检测结果显示：3种不同处理方式中，以完整种子浸提液为模板检测到的Ac浓度最高，“种壳+种仁”处理次之，而以磨碎种子浸提液为模板，则无检测数据。这与普通PCR的检测结果一致。

2.3 不同提取液对PCR和实时荧光定量PCR检测的影响

带菌甜瓜种子用3种不同的浸提液提取后，其PCR检测结果差异较大(图5)。处理c PCR扩增后无特异条带(279bp)出现。处理a和处理b均可扩增出目的条带，但处理a的条带较亮，检测效果最佳。

实时荧光定量PCR结果表明：以无菌水为浸提液检测到的Ac浓度最高，PBS为浸提液次之，以液体KB培养基为浸提液，则无检测数据。这与普通PCR的检测结果一致。

2.4 不同提取时间对PCR和实时荧光定量PCR检测的影响

如图6所示，带菌甜瓜种子加无菌水分别摇培3 h、6 h、12h后，PCR均能扩增出明显的特异条带(279bp)；但摇培24h时，则无目的条带出现。

实时荧光定量PCR结果显示：经3h、6h和12h摇培处理后，均能检测到较高的Ac含量，而摇培24h，则无检测数据。这与普通PCR的检测结果一致，表明摇培时间在3—12h为宜，至24h后，检测结果受到极大影响。

3 讨论

在传统PCR检测技术的基础上，本研究对甜瓜种子细菌性果斑病菌的检测方法进行了筛选优化。任毓忠等[15]研究表明，种皮的带菌量远远高于种仁。为了获得带菌量较多的浸提液模板，本研究对带菌种子进行了不同处理。结果表明，处理A(完整带菌种子加水摇培)和处理B(带菌种子去壳后，种壳和种仁一起加水摇培)均能通过PCR扩增出目的条带，条带亮度差异不明显，其实时荧光定量PCR均能检测到较高的Ac浓度。这说明用完整种子摇培后浸提液中的带菌量和种壳+种仁摇培后的带菌量接近，表明细菌性果斑病菌主要附着在种子表皮，这与任毓忠等[15]的研究结果一致。处理C(以磨碎种子浸提液为模板)的PCR扩增效果较差，可能是由于种子研碎后，大量蛋白、油脂等杂质混入浸提液，严重影响了PCR的扩增效率。综合比较，可直接用完整种子进行摇培检测。

本研究表明，带菌甜瓜种子经摇培3—12h，其PCR检测结果基本不受影响，均能扩增出明显的目的条带；但摇培至24h，却无目的条带出现。这可能与摇培24h后，部分甜瓜种子开始萌发，造成大量杂质混入浸提液影响PCR结果有关，其原因有待于进一步深入探讨。

不同引物的PCR扩增结果显示，引物BX-L1BX-S-R2的扩增效果最佳。而杜艳媚等[16]参照Bahar等[4]的方法，以西瓜果斑病菌菌液为模板，BX-L1BX-S-R2引物却不能扩增出目的片段，这可能是由于国内Taq DNA 聚合酶(Sigma-Aldrich)等PCR试剂与国外不同，因此反应条件也应做相应的改变，以获得最佳结果。本试验对BX-L1BX-S-R2引物扩增条件中的退火温度进行了优化调整，当退火温度降至60℃时，即可扩增出明显的目的条带。而对于实时荧光定量PCR，引物SEQID4mSEQID5则是最佳选择。因此对Ac进行检测时，应根据实际需求选用相应的引物。

综上，本研究优化得到的PCR检测方法简单快捷，不需要提取细菌的DNA，只需将完整种子用无菌水摇培3h后，以浸提液为模板，即可扩增出特异性的DNA片段。定性检测时，应首选引物BX-L1BX-S-R2进行普通PCR即可；若需要精准的定量检测，则可选用引物SEQID4mSEQID5进行实时荧光定量PCR分析。