利用SSR和ISSR分子标记分析崇明白扁豆种质资源的遗传多样性

沈 千，陈 岳，顾立君，潘俊松*

(1上海交通大学农业与生物学院，上海 200240，2 崇明区农业技术推广中心，上海202150，3上海市崇明区蔬菜科学技术推广站，上海202150)

崇明白扁豆，学名利马豆(PhaseoluslunatusL.)，起源于墨西哥南部和中美洲,引入我国时间不详[1]。崇明白扁豆是崇明地区重要的特色蔬菜品种之一，细嫩酥糯、清香味美、营养丰富，于2008年获得国家地理标志注册商标,具有十分良好的发展前景。但现阶段对崇明白扁豆研究较少，且主要集中在栽培和生理生化方面[2-4]，缺少有关崇明白扁豆的分类及亲缘关系的鉴定研究。此外，传统的通过株型、花色等形态学标记进行分类的方法，虽然能够在田间直接观察和统计，但形态学标记受到环境的限制，部分性状不能表达，以致不能发现确实存在的某些性状，使观测中的一些重要性状被隐藏或忽略。另外，田间性状调查所需的周期长，数据不稳定。而利用分子标记技术可以弥补形态学研究的短板，进一步体现种质的遗传多样性状况。

本试验所用材料为崇明白扁豆、云南大白芸豆和白扁豆。很多消费者误以为崇明白扁豆即为白扁豆，其实崇明白扁豆是俗称。崇明白扁豆，即利马豆，属于豆科(Leguminosae)菜豆属(Phaseolus)。云南大白芸豆(PhaseoluslunatusL.)在一些地方也被称为白扁豆，与崇明白扁豆是同属(菜豆属)同一个种，而白扁豆(LablabpurpureusL.)属于豆科(Leguminosae)扁豆属(Lablab)。本研究利用大豆SSR(Simple sequence repeat，简单重复序列)和ISSR(Inter-simple sequence repeat，简单重复序列中间区域)分子标记对64份种质材料进行遗传多样性分析，希望能揭示崇明不同地区崇明白扁豆之间的亲缘关系，并区分因俗称而被混淆的豆类名称，为今后崇明白扁豆的种质资源分类、鉴定以及品种保护提供理论依据和实践参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

参试的59份崇明白扁豆样本均由崇明区港西镇北双村晖远蔬菜园艺场提供；采购1份江苏海门的利马豆、1份云南丽江的大白芸豆和3份分别来自山东青岛、广西巴马、河南洛阳的白扁豆作对照(表1)；所有材料均为蔓生型。因为崇明白扁豆研究很少，相关SSR分子标记没有开发，所以采用同科的大豆SSR分子标记进行研究。

注：1—59号材料来源于上海崇明不同镇。数值均为平均值±标准差

1.2 试剂

试验所用的2×HieffTMPCR Master Mix购于上海翊圣生物科技有限公司；过硫酸铵、NaOH、硝酸银、98%去离子甲酰胺、二甲苯青、溴酚蓝、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺购于上海生工生物工程股份有限公司；无水乙醇、甲醛等购于国药集团化学试剂有限公司；琼脂糖购于北京沃比森科技有限公司。所用DNA引物由上海华津生物科技有限公司合成。

1.3 崇明白扁豆基因组DNA的提取

采用CTAB法[5]提取崇明白扁豆三出复叶时期的嫩叶片基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA溶液的质量，DNA纯度和浓度利用NanoDrop 2000紫外可见光谱仪(Thermo)进行测定。DNA溶液贮藏于-20℃备用。

1.4 SSR-PCR

PCR反应体系如下：5 μL 2×HieffTMPCR Master Mix，DNA模板1 μL(50 ngμL)；上下游引物(10 μmolL)各0.5 μL；添加ddH2O至10 μL。PCR扩增反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸5 min。

1.5 ISSR-PCR

采用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物，选取6个供试材料(样品3、11、25、36、48、63)，对引物进行多态性筛选。

PCR反应体系如下：5 μL 2×HieffTMPCR Master Mix，DNA模板1 μL(50 ngμL)；引物(10μmolL) 0.5 μL；添加ddH2O至10 μL体系。PCR扩增反应程序：预变性94℃ 3 min；变性94℃ 30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸5 min。

1.6 数据分析

PCR产物首先用2%琼脂糖凝胶电泳检测有无产物，有产物的再用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，硝酸银银染显色。白炽灯下观察电泳结果，进行数据统计和扫描照相。

扩增产物有带型记为“1”，无带型记为“0”，缺失数据记为“-”。采用NTSYSpc V2.11软件进行数据分析，以Jaccard计算遗传相似系数，利用非加权组平均法(UPGMA)对64份白扁豆种质资源进行聚类分析，构建系统进化树。多态性信息(PIC)值计算方法参照Botstein等[6]。

表2 大豆SSR分子标记的引物信息及其多态性

2 结果与分析

2.1 崇明白扁豆材料间多态性SSR和ISSR引物筛选

从48对大豆SSR引物中，筛选出11对带型清晰、多态性较好的引物，多态性比率为22.9%；从100条ISSR引物中筛选出19条扩增稳定、多态性好的引物，多态性比率为19.0%(表2和表3)，用筛选到的多态性引物分别对64份白扁豆材料进行PCR扩增。11对SSR引物共扩增出84条多态性条带，每个位点的等位基因数为3—12个，平均为7.6个(表2)；19条ISSR引物共扩增出151条多态性条带，每条引物扩增条带为5—13条，平均为7.9条(表3)。多态信息量(PIC)可以评估引物多态性信息量水平。本试验所筛选的11对SSR引物中，PIC值的范围为0.71(Satt385)到0.94(Satt520)；19条ISSR引物中，PIC值的范围为0.82(UBC827)到0.94(UBC834)，表明所筛选的引物具有较高的多态性，可以有效地用于白扁豆遗传多样性分析。图1和图2为SSR和ISSR分子标记的引物分别对2份崇明白扁豆进行PCR扩增后得到的电泳图谱。

表3 ISSR分子标记的引物信息及其多态性

2.2 崇明白扁豆材料聚类分析

2.2.1 利用SSR和ISSR分子标记聚类分析构建的树状图

采用NTSYSpc V2.11软件，分别利用大豆SSR和ISSR分子标记数据构建相应的树状图(图3和图4)。大豆SSR分子标记遗传相似系数介于0.39—0.99，其中材料5和19、38和46、60和62的相似系数最大，为0.9855。在相异系数0.74处，可将64份种质材料分成4类，材料64独自为第I类；材料60、62和63为第II类；材料27和61为第III类；剩下的材料均来自崇明，为第IV类，包括材料1—26和28—59(图3)。ISSR分子标记遗传相似系数介于0.33—1.00，其中材料51和54，44、45和46相似系数最大，为0.9968。ISSR分子标记在相异系数0.86处，也可将64份种质材料分成4类，材料64独自为第I类；材料60、62和63为第II类；材料59和61为第III类；剩下的材料均来自崇明，为第IV类，包括材料1—58(图4)。比较图3和图4，SSR和ISSR两种分子标记获得了相似但不完全相同的聚类树，说明两种分子标记之间存在一定的差异,但都能较好地分析崇明白扁豆的遗传差异。图3中材料27与61为一类；而图4中材料59与61为一类，表明不同分子标记技术所能检测到的多态性比率不同。

2.2.2 综合SSR和ISSR分子标记构建的树状图

将两种分子标记分析的数据一起用NTSYSpc V2.11软件进行聚类分析，得出64份供试材料的聚类树状图(图5)，遗传相似系数范围为0.37—1.00。在相似系数0.82处，可将材料分为4个类群。材料64独自成为第I类；材料60、62和63为第II类；材料27和61为第III类；剩下的材料均来自崇明，为第IV类，包括材料1—26和28—59。其中，相似系数最大的是材料45和46，为0.9957，表明其遗传相似度较高，亲缘关系较近；相似系数最小的是材料44和63，为0.2808，表明其遗传相似度较低，亲缘关系较远。

由两种分子标记综合聚类(图5)与SSR分子标记聚类(图3)、ISSR分子标记聚类(图4)比较可知，两种分子标记综合聚类与SSR分子标记聚类和ISSR分子标记聚类基本一致。两种分子标记综合聚类和SSR分子标记聚类大体一致，而ISSR分子标记和前面两者差异性体现在第III类。ISSR分子标记聚类图中第III类是材料59与61，而综合聚类图和SSR分子标记聚类图中第III类是材料27与61，其主要原因可能是两种分子标记所检测的基因座位不同，SSR分子标记检测的是重复序列，而ISSR分子标记检测的是重复序列中间区域。

2.3 崇明白扁豆性状与SSR和ISSR分子标记的相关性分析

综合参试材料的性状(表1)和聚类结果(图5)，崇明白扁豆大多数聚类在一起，单一性状基本呈聚集式分布。在花色上，类群IV和类群III呈淡黄色；类群I呈淡紫色；类群II为紫色。在种荚颜色上，除类群IV的材料26和53呈淡绿色外，其他材料均呈绿色。在豆色上，类群I呈乳白色；类群II呈黄白色；类群III呈淡绿色；类群IV除了材料26和53呈紫色，其余呈淡绿色。在鲜百粒重方面，材料1—63基本接近一致。综上所述，类群III和类群IV亲缘关系最近。

3 讨论

3.1 ISSR和大豆SSR分子标记在植物中的应用

目前,在开放的基因组信息中，关于利马豆的基因组信息相对较少,针对利马豆开发SSR分子标记的成本费用相对较高。但是已有研究发现，豆科植物中的SSR分子标记具有通用性[7-8]。相比于利马豆，大豆植物的基因组已经开发出了相当多的SSR分子标记。姚陆铭等[9]对源自中国、美国、泰国及印度的31份扁豆资源样本进行SSR分子标记分析，发现大豆的SSR分子标记能很好地适用于扁豆的遗传多样性分析；扁豆资源主要可以分为3组且相互间无地域特异性差异，这表明扁豆资源中遗传多样性相对较低。相比于SSR分子标记，ISSR分子标记的标记效率较高，在指纹图谱构建时可用较少的引物区分不同的品种，但在试验的重复性方面差于SSR分子标记[10-12]。肖志娟[13]对不同核桃品种遗传多样性的研究表明，在多态位点数的有效性方面，ISSR分子标记略高于SSR分子标记；在遗传差异性方面，SSR分子标记略高于ISSR分子标记。SSR分子标记的多态性程度高，且呈共显性遗传，符合孟德尔遗传规律。李永祥等[14]通过SSR和ISSR分子标记对12份披碱草属植物进行遗传多样性比较分析，发现两种分子标记效率和相关性在不同亲缘关系水平上有所不同,说明不同的标记具有不同的多态性检测范围。综合上述考虑，本研究利用大豆的SSR分子标记和ISSR分子标记对利马豆的遗传多样性进行分析。从本研究结果可以看出，大豆的SSR分子标记比ISSR分子标记更能有效地区分崇明白扁豆的亲缘关系。

3.2 崇明白扁豆种质资源分析

本研究显示，64份种质材料的SSR分子标记多态性比率为22.9%，ISSR分子标记多态性比率为19.0%。所收集的利马豆材料间的遗传相似系数变幅较小，在0.84—1.00，表明其差异性不明显，相似性较大。综合分析表明，崇明白扁豆亲缘关系十分相近，遗传背景狭窄，区别较小，同一来源地的材料趋于聚为一类。这可能是由于崇明白扁豆长期改良、优质栽培并应用推广，导致所收集的种质材料趋于接近，从而使崇明白扁豆亲缘关系接近。来自江苏海门的材料61利马豆与崇明白扁豆的亲缘关系最接近，江苏海门与上海崇明岛仅一江之隔，可以看出，相邻的材料来源地存在亲缘关系接近的现象。来自广西的白扁豆(60)、河南的白扁豆(62)、山东的白扁豆(63)聚为一类；来自云南的大白芸豆(64)单独聚为一类，分子标记分析很容易区分白扁豆、大白芸豆与崇明和江苏海门利马豆之间的关系，准确揭示崇明白扁豆(利马豆)、白扁豆、大白芸豆的亲缘关系。