秀珍菇粉对H22荷瘤小鼠体内抗肿瘤作用研究

吕建敏，龚金炎，刘士旺

(1. 浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究所，杭州 310053； 2. 浙江科技学院生物与化学工程学院/轻工学院，杭州 310023)

原发性肝癌位居全球肿瘤死亡率第2位[1]，常用的手术和西药疗法存在疗效欠佳且药物不良反应严重等问题，而副作用较小的中草药抗癌制剂在肿瘤辅助治疗中具有独特优势[2]。小鼠肝癌22(H22)是最常用的小鼠可移植性肿瘤细胞系之一，广泛用于肿瘤动物模型复制，在中草药抗肿瘤药效学评价中发挥着重要作用[3-5]。秀珍菇Pleurotusgeesteranus是一种珍稀的药食兼用食用菌，隶属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，侧耳科，侧耳属[6]，研究发现，秀珍菇中所含多糖具有抗氧化、抗炎、抗衰老、保护肝等药理功效[7-10]。尽管目前已利用H22荷瘤小鼠模型证实许多药食兼用食用菌及其提取物具有抗肿瘤功效，且其抑瘤作用主要源于食用菌中的活性成分对机体免疫和抗氧化功能的改善[11-13]，但对秀珍菇的相关研究仍主要集中在多糖提取及其他药理作用上[7-10]，还鲜有秀珍菇抗肿瘤作用的报道。我们前期研究发现，秀珍菇粉具有增强机体免疫功能和抗氧化的作用(尚未发表)，据此推测，秀珍菇可能也具有抗肿瘤功效。因此，本研究使用H22荷瘤小鼠模型，研究秀珍菇体内抗肿瘤作用效果和机制，旨在为后续秀珍菇药品和功能食品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 秀珍菇粉

新鲜秀珍菇由浙江省缙云县珍稀食用菌专业合作社生产，并由浙江科技学院刘士旺教授鉴定。将新鲜秀珍菇于50 ～ 70℃下烘8 h，磨成粉末，过40目筛后装在封口袋中放置于阴凉干燥处保存。秀珍菇粉末主要营养成分经绿城农科检测技术有限公司检测，结果见表1。

表1 秀珍菇粉主要营养成分表Table 1 Nutrient values of Pleurotus geesteranus fuit body powder

1.1.2 实验动物与瘤株

60只雄性SPF级ICR小鼠，年龄为4周龄，体重为17 ～ 20 g，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2018-0006】。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心SPF级动物实验室【SYXK(浙)2018-0012】。饲养期间各组小鼠自由饮水，饲喂小鼠维持饲料由仪征安利卯生物科技有限公司提供。饲养环境：昼夜各半循环照明，相对湿度40% ～ 70%，温度控制在22 ～ 25℃，并按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。所有操作均符合浙江中医药大学动物实验研究中心动物实验伦理学要求(审批号：IACUC 2018091705)。H22小鼠肝癌瘤株购于中国医学科学院，由浙江中医药大学动物实验研究中心传代保种。

1.1.3 试剂与仪器

环磷酰胺(CTX，Meilunbio，M0915A)；注射用氯化钠(浙江国镜药业有限公司，B18050702)；小鼠免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)、小鼠细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-2)酶联免疫检测试剂盒(南京建成生物公司，20181206)；SOD、GSH-Px、CAT和MDA检测试剂盒(南京建成生物公司，批号分别为20181207、20180817、20181205、20181208)。

电子天平(JJ300，常熟双杰测试仪器厂)；电子分析天平(Mettler Toledo，瑞士)。酶标仪(BIO-RAD，美国)。MICROM AP-280组织包埋机、MICROM HM-335E型轮转切片机(MICROM，德国)；LEICA染色机(LEICA，瑞士)，NanoZoomer -2.0RS数字切片扫描仪(滨松光电，日本)。

1.2 方法

1.2.1 荷瘤小鼠实体瘤模型的建立

按常规方法复苏H22小鼠肝癌细胞，取0.2 mL细胞悬液注射到雄性ICR小鼠腹腔内，连续传两代获得H22腹水瘤小鼠，用于本实验。依据参考文献[12, 14]的方法，在超净工作台中，取H22腹水瘤小鼠的腹水，经生理盐水清洗后稀释成浓度为 1×106/mL细胞悬液，按每只0.2 mL接种剂量接种于经适应性喂养1周后的ICR小鼠左侧腋部皮下。

1.2.2 分组、给药

ICR小鼠接瘤24 h后随即分组，即模型组(Modle)、环磷酰胺阳性药组(CTX)、秀珍菇低(PGP-L)、中(PGP-M)、高(PGP-H)剂量组，每组10只小鼠，另取10只正常小鼠作为空白对照组(Blank)。依据参考文献[12,15]设置CTX和秀珍菇给药剂量，空白组不给药及生理盐水，模型组灌服生理盐水，阳性药组隔天按20 mg/kg 体重的剂量腹腔注射CTX生理盐水溶液，秀珍菇低、中、高剂量组分别按750、1500和3000 mg/kg 体重每天剂量灌服秀珍菇粉生理盐水混悬液。各组小鼠接种瘤株后第2天开始给药，给药容量为 0.2 mL/10 g，连续给药10 d。

1.2.3 肿瘤抑制率和脏器指数测定

末次给药24 h后麻醉处死小鼠，剥取瘤块，取脾、胸腺，称重并计算抑瘤率和免疫器官脏器指数。肿瘤生长抑制率=(模型组平均瘤重 - 给药组平均瘤重)/ 模型组平均瘤重×100%；脏器指数=脏器质量(g)/体重质量(g)×100。

1.2.4 血清免疫球蛋白和细胞因子测定

实验结束，小鼠颌下静脉取血，分离血清，参照试剂盒说明书，利用酶联免疫(ELISA)法测定小鼠血清中 IgA，IgG和 IgM含量及TNF-α，IL-6和IL-2的含量。

1.2.5 肝、肾组织抗氧化指标测定

麻醉处死小鼠，取肝、肾，制备肝、肾匀浆，参照试剂盒说明书，利用酶标仪测定分别测定小鼠肝、肾中SOD，GSH-Px和CAT的活性及MDA含量。

1.2.6 肿瘤和脾的组织病理学观察

分别取各组小鼠瘤块和脾，置于4%中性甲醛固定，将固定好的组织用常规石蜡包埋，再将石蜡包埋块切片、脱蜡，进行HE染色，最后用数字切片扫描仪对切片进行图像扫描。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 H22荷瘤小鼠模型成模和带瘤生存情况

自接种H22瘤株第3天起，所有荷瘤小鼠腋窝处均出现明显瘤组织，并逐天增大，表明模型复制成功。在实验期间，所有荷瘤小鼠无自然死亡情况。

2.2 小鼠平均瘤重和肿瘤抑制率

由表2可见，阳性药组及秀珍菇各剂量组小鼠平均瘤重均极显著低于与模型组(P< 0.01)；肿瘤抑制率以阳性药组最高、秀珍菇高、中剂量组次之，秀珍菇低剂量组最低。

2.3 小鼠脾指数和胸腺指数

由图1可见，与空白组比较，模型组、阳性药组和秀珍菇各剂量组小鼠脾指数均极显著升高(P< 0.01)，阳性药组小鼠胸腺指数显著降低(P< 0.05)。秀珍菇各剂量组小鼠的脾和胸腺指数都有高于阳性药组的趋势，其中高剂量组的脾指数与阳性药组比较有显著性差异(P< 0.05)。

表 2 秀珍菇粉对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的的影响Table 2 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on growth of tumor in H22 tumor-bearing mice

注：同列数值肩标上无字母或有相同字母表示差异不显著(P> 0.05)，肩标上小写字母不同表示差异显著(P< 0.05)，肩标上大写字母不同表示差异极显著(P< 0.01)。下表同。

Note. In the same line, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P> 0.05), while values with different small letter superscripts mean significant difference (P< 0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P< 0.01). The same in the flowing tables.

注：各组间比较，小写字母不同表示差异显著(P< 0.05)，大写字母不同表示差异极显著(P< 0.01)。图1 秀珍菇粉对H22荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的影响Note. Compared among groups, values with different small letter superscripts mean significant difference (P< 0.05), and with different capital letter superscripts mean very significant difference (P< 0.01).Figure 1 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on spleed and thymus indices of H22 tumor-bearing mice

2.4 小鼠血清免疫球蛋白及细胞因子含量

由表3可知，与空白组比较，模型组小鼠血清IgA和TNF-α含量显著升高(P< 0.01，P< 0.05)，模型组和秀珍菇中剂量组小鼠血清IL-2含量显著降低(P< 0.01，P< 0.05)，模型组和秀珍菇低、中剂量组小鼠血清IL-6含量有上升趋势(P> 0.05)。与模型组比较，阳性药组和秀珍菇各剂量组小鼠血清IgA和TNF-α含量显著降低(P< 0.01，P< 0.05)，阳性药组和秀珍菇低剂量组小鼠血清IL-2含量显著升高(P< 0.05)，秀珍菇高剂量组小鼠血清IL-6含量也显著低于模型组(P< 0.05)。

2.5 小鼠肝组织抗氧化指标

由表4可知，与空白组比较，模型组小鼠肝MDA含量显著升高(P< 0.05)，GSH-Px和CAT活力极显著降低(P< 0.01)；阳性药组和秀珍菇各剂量组小鼠肝GSH-Px活性显著降低(P< 0.05，P< 0.01)。与模型组比较，阳性药组、秀珍菇各剂量组小鼠肝CAT活性均显著升高(P< 0.05，P< 0.01)，秀珍菇中、高剂量组肝GSH-Px活力显著高于模型组(P< 0.05)，而秀珍菇中剂量组小鼠肝MDA含量显著低于模型组(P< 0.05)。

2.6 小鼠肾组织抗氧化指标

由表5可知，模型组小鼠肾组织SOD、GSH-Px和CAT活性均显著低于空白组(P< 0.01，P< 0.05，P< 0.01)。与模型组比较，阳性药组和秀珍菇各剂量组小鼠肾SOD和CAT活性极显著升高(P<0.01)，秀珍菇低、中剂量组小鼠肾GSH-Px活性也显著高于模型组(P< 0.05)。

2.7 荷瘤小鼠肿瘤细胞形态学观察

由图2可见，模型组肿瘤细胞形状多呈椭圆形，体积大小不同，且排列密集，极少有出血坏死情况；CTX组的肿瘤细胞排列松散且呈不规则变形，多数肿瘤细胞破裂有明显的胞浆溢出；秀珍菇各剂量组均可观察到有肿瘤坏死细胞，且细胞形状不规则，特别是秀珍菇中、高剂量组出现细胞破裂、坏死细胞堆积的情况较为明显。

表 3 秀珍菇粉对H22荷瘤小鼠血清免疫球蛋白及细胞因子含量的影响Table 3 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on serum contents of immunoglobulins and cytokines in H22 tumor-bearing mice

表 4 秀珍菇粉对H22荷瘤小鼠肝组织抗氧化指标的影响Table 4 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on antioxidant indices in liver of H22 tumor-bearing mice

表 5 秀珍菇粉对H22荷瘤小鼠肾组织抗氧化指标的影响Table 5 Effects of Pleurotus geesteranus fruit body powder on antioxidant indices in kidney of H22 tumor-bearing mice

2.8 小鼠脾组织形态学观察

由图3可见，空白组小鼠脾细胞排列正常，红髓与白髓两者分界清晰，模型组和秀珍菇各剂量组小鼠脾细胞均较空白组增多，模型组脾红髓与白髓分界模糊，CTX组和秀珍菇低剂量部分区域出现脾红髓与白髓模糊不清现象，秀珍菇中、高剂量组脾红髓与白髓两者分界较清晰。

3 讨论

3.1 秀珍菇对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用

食用菌抗肿瘤作用及有效成分提取近年来备受关注[16]，已有研究表明，香菇、灰树花、猴头菇、灵芝等药食兼用食用菌均具有抗肿瘤功效[11-12, 17-18]，并发现食用菌中多糖是主要抑瘤活性成分[11,19]。目前有关秀珍菇及其提取物的药理作用研究主要侧重于抗氧化、抗炎、保护肝等方面[7-9]，很少涉及抗肿瘤作用研究，因此，我们在前期研究发现秀珍菇粉具有抗氧化、增强免疫功能的基础上(还未发表)，进一步研究秀珍菇的抑瘤功效。本研究首先建立H22荷瘤小鼠模型，发现小鼠腋部接种H22瘤株3 d后即出现明显肿块，病理切片观察结果显示模型组小鼠肿瘤细胞呈椭圆形，且排列密集，表明肿瘤模型建立成功。研究还发现，低、中、高剂量秀珍菇均具有的抑瘤效果，秀珍菇中、高剂量组抑瘤率分别达到47.47%和48.80%，已接近阳性药CTX的抑瘤效果(55.08%)，符合抗肿瘤中草药有效性的标准(抑瘤率 > 30%)要求[20]。从病理切片上也观察到荷瘤小鼠经秀珍菇处理后出现了肿瘤细胞坏死，且坏死区域明显增加现象，充分验证了秀珍菇的抑瘤效果。

3.3 秀珍菇对H22荷瘤小鼠的免疫功能影响

脾指数和胸腺指数分别反映体液和细胞免疫功能[3]。本试验发现小鼠荷瘤后脾过度增大，脾细胞明显增多，这与荷瘤后各类免疫细胞转移至脾后滞留有直接的关系[21]。环磷酰胺(CTX)主要通过免疫抑制来发挥抗肿瘤作用[22]，本试验结果显示，CTX组小鼠胸腺指数显著低于空白组，脾指数有低于模型组趋势，且脾红髓与白髓模糊不清，而秀珍菇各剂量组小鼠脾指数和胸腺指数均高于CTX组，且秀珍菇中、高剂量组小鼠脾红髓与白髓两者分界也较清晰，说明秀珍菇抗肿瘤机制与CTX不同，可能是通过保护免疫器官提高机体免疫力来达到抑瘤固本效果。

图2 H22荷瘤小鼠肿瘤细胞 HE 染色切片(×200)Figure 2 HE stained sections of tumor cells from H22 tumor-bearing mice (×200)

图3 小鼠脾细胞HE染色切片(×200)Figure 3 HE stained sections of spleen cells in mice (× 200)

免疫球蛋白是反映机体体液免疫功能指标。研究显示动物荷瘤后血清免疫球蛋白会发生异常表达，导致功能失调[23]。本试验发现小鼠荷瘤后血清IgA含量异常升高，而秀珍菇能显著降低荷瘤小鼠血清IgA水平，说明秀珍菇对荷瘤小鼠体液免疫功能也具有调节作用。

TNF-α、IL-2和IL-6等细胞因子通过结合相应受体调节细胞生长、分化，调控免疫应答[24]。一定浓度范围内的TNF-α具有组织修复功能，但TNF-α浓度异常升高可引起组织损伤[25]。很多肿瘤细胞会产生TNF-α，反过来TNF-α和IL-6等炎性因子又可刺激肿瘤生长[24]。而IL-2可促进T细胞和自然杀伤细胞功能，在抑制肿瘤细胞生长的特异性免疫反应中起重要作用[26]。在本试验中，小鼠荷瘤后，出现血清TNF-α含量显著上升，IL-2含量显著下降，IL-6含量有上升趋势等异常改变，而经秀珍菇处理后，上述异常改变得到逆转，说明秀珍菇对荷瘤小鼠细胞因子水平具有正向调节作用。

3.3 秀珍菇对H22荷瘤小鼠肝、肾组织抗氧化能力的影响

肿瘤的发生发展与宿主的自由基水平及其代谢产物有关[27-28]。SOD、CAT和GSH-Px等抗氧化酶活性降低会导致机体清除自由基能力下降，引起氧自由基和MDA的堆积，造成机体损伤[29]。本试验观察到，小鼠荷瘤后，肝MDA含量显著上升，肝和肾部分抗氧化酶活性显著降低，而与模型组比较，秀珍菇各剂量组小鼠肝CAT活性及肾SOD和CAT活性显著升高，秀珍菇中、高剂量组小鼠肝GSH-Px活力及低、中剂量组肾GSH-Px活性均显著升高，而秀珍菇中剂量组小鼠肝MDA含量显著降低，表明秀珍菇能显著提高荷瘤小鼠抗氧化能力，并能清除过量表达自由基，从而起到抑制肿瘤生长和保护正常组织作用。

综上所述，秀珍菇可显著降低荷瘤小鼠平均瘤重，具有较好的抑肿瘤作用，并具有抗氧化和免疫调节功能。由此推测秀珍菇抗肿瘤的可能机制为：通过提高机体抗氧化能力，清除体内过量自由基，下调异常升高的血清TNF-α和IL-6水平，减轻自由基和高浓度炎性细胞因子对组织损伤，进而改善机体在荷瘤状态下的免疫细胞活性，抑制肿瘤生长；同时通过上调血清IL-2水平, 间接提高T细胞和NK细胞活性，促进肿瘤细胞坏死和凋亡，最终达到抗肿瘤效果。秀珍菇体内抗肿瘤作用也可能还有其他作用机制，尚需进一步研究。