慢性炎性痛模型大鼠诱发焦虑抑郁样情绪行为观察

邵芳冰，房军帆，王思思，孙海榉，项璇儿，方剑乔，杜俊英

(浙江中医药大学第三临床医学院 针灸神经生物学实验室，浙江杭州 310053)

慢性疼痛的患者不仅有痛苦的躯体感觉，还常出现抑郁和焦虑等不良情绪反应，这种高共病率极大的影响人们的身心健康和生活质量，已引起现代社会的广泛关注[1-2]。据流行病学研究报告显示慢性疼痛患者中，高达54%的疼痛患者患有抑郁症以及高达50%患者患有焦虑症[3]，尽管这些疼痛相关症状经常在人类中被观察到，但迄今为止，研究慢性炎性痛和情绪障碍之间关系的动物研究十分有限且结果不统一[4-6]，抑郁和焦虑样情绪和慢性疼痛之间的相互作用机制尚不清楚。

二十世纪以来，以动物疼痛行为测量为特征的实验研究变得越来越普遍，通过动物行为，实验动物可以对有害刺激做出直接的反应，并且通过行为表达自身的情绪感受，规避人为的主观性，客观可靠的得出实验结论[7]。

本研究旨在通过目前神经科学领域多种常用的动物行为检测方法，动态的观察弗氏完全佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)诱导的慢性炎性痛大鼠模型不同时间点机械缩足阈变化以及其诱发的痛情绪改变情况，为进一步进行痛情绪的机制及干预研究，提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

清洁级健康雄性SD 大鼠16只，体重(200 ± 20)g，购自中国科学院上海实验动物中心【SCXK(沪)2018-0006】，由浙江中医药大学动物实验研究中心饲养【SYXK(浙)2018-0012】。饲养期间大鼠给予啮齿类动物标准颗粒饲料(由实验动物中心提供)，每4只大鼠饲养一笼[室温(23±2)℃，湿度40% ～ 60%]，笼底铺满无菌玉米芯颗粒垫料，自由进水，饲养环境安静，有良好的通风和空气过滤系统，12 h:12 h昼夜循环光照。本实验所有操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》。

1.1.2 仪器与试剂

弗氏完全佐剂(CFA，Sigma 公司，美国)，Von Frey纤维丝(Thermo，美国)，高架O迷宫(瑞沃德，中国)，旷场(瑞沃德，中国)，Smart 3.0分析软件(Panlab，美国)，蔗糖(源叶生物，中国)。

1.2 方法

1.2.1 分组及造模

分组：运用Spass软件将大鼠完全随机分为空白对照组(n=8)，模型对照组(n=8)。

造模：参考本课题组以往造模方法[8]，模型对照组于大鼠左侧足底皮下注射CFA 0.1 mL，建立慢性炎性痛模型。空白对照组于相同部位注射等量无菌生理盐水。

1.2.2 机械缩足阈(paw withdrawal thresholds，PWTs)

在安静环境下，将大鼠置于铁丝网上透明有机玻璃箱内(20 cm × 20 cm × 15 cm)，自由探索并适应环境30 min，待大鼠安静后，采用Chaplan 等[9]建立的Von-Frey纤维丝方法测量机械缩足阈，采用(0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0、26.0 g)纤维丝套组，强度从4.0 g开始，用纤维丝依次刺激大鼠左后爪足底皮肤中央，避开足垫，用足够的力量，对脚掌造成轻微屈曲，维持6 ～ 8 s。如果大鼠有明显的缩足、甩足、抬足及舔足反应时，认为是阳性反应，就更换到相邻小一号力量刺激丝；如果没有反应，就更换到相邻大一号力量刺激丝。记录结果：出现明显的躲避反应则记为“X”；若无反应则记为“O”，以出现第一对交叉符号作为起点，再连续测4次，得到一串以“O”或“X”组合的序列。用公式：机械缩足阈(g)=(10[Xf+κδ])/10000，计算并记录。若连续5次刺激均为“O”则记为26.0 g，反之若刺激均为“X”则记为0.4 g。若计算得出PWTs > 26.0 g或 < 0.4 g，仍以26.0 g或0.4 g作为最大或最小值。

1.2.3 旷场实验(open field test，OF)

旷场实验参考温存等[10]的实验方法，保持实验室较暗的光线，避免直射光线，恒定温度[(23±2)℃左右]，保持环境安静，测试前先将待测实验大鼠放入实验环境中30 min以适应环境。本实验在100 cm × 100 cm × 50 cm的无盖方箱中进行，用Smart 3.0软件将旷场划为16个格子，中间4格为中央区，其他12格为周围区。开始时将实验大鼠头部背对实验者轻缓放入旷场实验箱中央区中，实验人员远离高架O迷宫，进行摄像。大鼠在旷场中先适应30 s，再记录5 min的活动情况，分析实验动物在旷场的中央区运动距离，中央区进入次数、中央区停留时间和总运动距离。为消除动物气味的嗅觉刺激，每次测量前均用10%的酒精清洗迷宫平台，以消除上一次大鼠留下的信息(如气味，大小便等)。

1.2.4 高架O迷宫实验(elevated zero maze，EZM)

环境、适应条件及参考文献同旷场。本实验在直径100 cm，高50 cm的圆形平台上进行，圆形平台由两个开放臂和闭合臂组成。测试前先将待测实验大鼠放入实验环境中30 min以适应环境。开始时将实验大鼠轻缓地放置于闭合臂和开放臂的交界，要求实验大鼠头面向开放臂，实验人员远离高架O迷宫，进行摄像。大鼠在O迷宫中先适应30 s，再记录5 min的活动情况。用Smart 3.0软件进行数据析，观察并计算实验大鼠高架O迷宫开放臂运动距离、开放臂进入次数、开放臂停留时间和总运动距离。为消除动物气味的嗅觉刺激，每次测量前均用10%的酒精清洗迷宫平台，以消除上一次大鼠留下的信息(如气味，大小便等)。

1.2.5 新奇食物抑制实验(novelty-suppressed feeding test，NSF)

新奇食物抑制实验在Yalcin等[11]的实验方法基础上加以改进。实验室需明亮，恒定温度[(23 ± 2)℃左右]，环境安静。实验在40 cm × 40 cm × 30 cm黑色木箱中进行，箱底均匀覆盖1 cm厚度的玉米芯垫料。在箱底中央白纸上放置一颗食物。实验大鼠禁食不禁水24 h，测试之前先将待测实验大鼠放入实验环境中30 min以适应环境，实验时从任意的箱角将大鼠放入箱内，通过摄像系统观察5 min，记录大鼠第1次啃食食物所用的时间即摄食潜伏期。在大鼠开始啃食食物后，立即将大鼠单独转移至笼子中，将称重的食物放置5 min后，记录预先称重的食物的剩余重量，以排除食欲差异对进食时间的影响。若大鼠在5 min内未啃食食物，即记为5 min，随后仍将大鼠单独转移至笼子中，进行食物消耗实验。

1.2.6 大理石埋藏实验(marble-burying test，MBT)

大理石埋藏实验在许笑笑等人的实验方法上稍作改进[12]，环境及适应条件同NSF。将大鼠单独放入(40 cm × 25 cm × 20 cm)的笼子中，在笼中铺上5 cm厚度的玉米芯垫料。笼内装有9个直径为2.5 cm的玻璃弹珠，以“3×3×3”形式排开。将大鼠单独依次放入笼中，记录大鼠10 min内掩埋玻璃弹珠颗数，其中玻璃弹珠2/3及以上体积被玉米芯垫料覆盖，则认为大理石被掩埋。

1.2.7 糖水偏爱实验(sucrose preference test，SPT)

糖水偏爱实验在肖婷等人实验方法上稍作修改[13]。实验前，每只大鼠均单笼饲养，预适应2 d，预适应第1天两瓶1%蔗糖水自由饮用，预适应第2天1%蔗糖水和纯水自由饮用。实验时，大鼠禁水24 h，然后将事先称量好的等量1%蔗糖水和纯水放入笼中，隔12 h后，调换糖水和纯水的位置，以避免位置偏爱所造成的干扰，24 h后对糖水和纯水进行称重，记录每只大鼠的液体摄入量。计算公式为：糖水偏好度(%)=糖水摄入量/(糖水摄入量+纯水摄入量)×100%。

1.2.8 实验设计

本研究通过在大鼠左侧足底注射CFA建立慢性炎性痛模型，通过多时间点检测PWTs改变情况；通过OF、EZM、NSF、MBT和SPT方法观察其焦虑抑郁样情绪行为变化，实验安排详见图1。

图1 实验流程图Figure 1 Experimental flow chart

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 慢性炎性痛模型大鼠不同时间点机械缩足阈改变情况

我们在造模前基础(base)和造模后1，3，7，18和26 d，测量所有大鼠的PWTs。由图2可见，两组大鼠造模前基础PWTs比较，差异均无统计学意义(P> 0.05)；造模后1 d，与空白对照组相比，模型对照组大鼠患侧PWTs明显下降，差异具有统计学意义(P< 0.01)，提示CFA致炎性痛模型成功建立；造模后1，3，7，18和26 d，模型对照组大鼠患侧PWTs均显著低于空白对照组大鼠，差异具有统计学意义(P< 0.01)。

2.2 慢性炎性痛模型大鼠旷场实验结果

我们在造模后28 d进行旷场实验，观察慢性炎性痛模型大鼠的焦虑样情绪。由图3可见，与空白对照组相比，模型对照组大鼠中央区运动距离、中央区停留时间和中央区进入次数显著减小，差异具有统计学意义(P< 0.01)，结果表明模型对照组大鼠较空白对照组大鼠焦虑行为增加，出现焦虑样情绪；两组大鼠旷场内总距离比较，差异无统计学意义(P> 0.05)，结果表明模型对照组大鼠未出现运动能力的改变。

注：与空白对照组相比，**P < 0.01。图2 各组大鼠不同时间点机械缩足阈变化情况Note. Compared with the control group,**P < 0.01.Figure 2 Changes of paw withdrawal thresholds at different time points in each

2.3 慢性炎性痛模型大鼠高架O迷宫实验结果

我们在造模后29 d进行高架O迷宫实验，观察慢性炎性痛模型大鼠的焦虑样情绪。由图4可见，与空白对照组相比，模型对照组大鼠开放臂运动距离、开放臂停留时间和开放臂进入次数显著减小，差异具有统计学意义(P< 0.05)，结果表明模型对照组大鼠较空白对照组大鼠焦虑行为增加，出现焦虑样情绪；两组大鼠高架O迷宫内总距离比较，差异无统计学意义(P> 0.05)，结果表明模型对照组大鼠未出现运动能力的改变。

2.4 慢性炎性痛模型大鼠新奇食物抑制实验结果

我们在造模后30 d进行新奇食物抑制实验，观察慢性炎性痛模型大鼠的焦虑样情绪。由图5可见，与空白对照组相比，模型对照组大鼠摄食潜伏期显著增加，差异具有统计学意义(P< 0.05)，结果表明模型对照组大鼠较空白对照组大鼠焦虑行为增加，出现焦虑样情绪；模型对照组大鼠与空白对照组大鼠5 min食物消耗实验无统计学差异(P> 0.05)，表明两组大鼠无食欲差异。

注：与空白对照组相比，**P < 0.01。图3 各组大鼠旷场行为学变化情况Note. Compared with the control group,**P < 0.01.Figure 3 Behavioral changes of open field of rats in each group

注：与空白对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01。图4 各组大鼠高架O迷宫行为学变化情况Note. Compared with the control group, *P < 0.05, **P < 0.01.Figure 4 Behavioral changes of elevated zero maze of rats in each group

注：与空白对照组相比，*P < 0.05。图5 各组大鼠新奇食物抑制实验行为学变化情况Note. Compared with the control group,*P < 0.05.Figure 5 Behavioral changes of novelty-suppressed feeding test of rats in each group

2.5 慢性炎性痛模型大鼠大理石埋藏实验结果

我们在造模后12，20和31 d进行大理石埋藏实验，观察慢性炎性痛模型大鼠的焦虑样情绪。由图6可见，与空白对照组相比，在模后12和20 d进行大理石埋藏实验，模型对照组大鼠掩埋大理石颗数无明显增加，差异无统计学意义(P> 0.05)；模后31 d，模型对照组大鼠较空白对照组大鼠掩埋大理石颗数明显增加，差异有统计学意义(P< 0.05)；结果表明在模后31 d模型对照组大鼠较空白对照组大鼠焦虑行为增加，出现焦虑样情绪。

注：与空白对照组相比，*P < 0.05。图6 各组大鼠大理石埋藏实验行为学变化情况Note. Compared with the control group,*P < 0.05.Figure 6 Behavioral changes of marble-burying test of rats in each group

2.6 慢性炎性痛模型大鼠糖水偏爱实验结果

我们在模后17，25和35 d进行糖水偏爱实验，观察慢性炎性痛模型大鼠的抑郁样情绪。由图7可以可见，与空白对照组相比，在模后17，25和35 d模型组大鼠糖水偏爱度无明显降低，差异无统计学意义(P> 0.05)。结果表明，模型对照组大鼠未出现抑郁样情绪。

图7 各组大鼠糖水偏爱实验行为学变化情况Figure 7 Behavioral changes of sucrose preference test of rats in each group

3 讨论

慢性疼痛的特点是持续的伤害性疼痛过敏，慢性疼痛患者多表现出焦虑、抑郁等不良的负性情绪，这些共病导致的后果远远超出了疼痛本身[14]。越来越多的学者已经认识到痛相关情绪反应在疼痛中的重要性，对解开疼痛和不良情绪共病之间的关系充满兴趣。大量研究通过疼痛患者和啮齿类动物疼痛模型的脑成像发现，大脑灰质体积、白质完整性甚至表观遗传变化都发生了变化[15]。目前共病的干预手段及机制研究正在迅速成为一大热点，但动物不同于人类，无法用言语直接表达自身的感受，故行为学是最可观且可靠表达情绪的检测方法，故有着不可忽视的重要性。

慢性炎性痛是由持续性或未解决的炎症引起的疼痛，CFA诱导的慢性炎性痛模型具有制备简单、重复性强的优点，是一种被国内外广泛认可的慢性炎性痛模型。CFA注射后1 d，大鼠足跖出现红、肿、热、痛，痛阈出现明显的降低，这种持续的痛觉过敏可维持4 ～ 8周[16]。本实验显示在大鼠左侧足底皮下注射0.1 mL CFA，模后1 d大鼠PWTs显著降低，与空白对照组相比差异具有统计学意义，该结果与以往研究结果相一致[17]。由于神经病理痛相较于慢性炎性痛可维持的痛觉过敏时间更长，研究痛情绪的时间跨度更广，许多研究人员会偏爱神经病理痛模型[18-19]，所以目前针对慢性炎性痛诱导的痛情绪研究相对十分有限并且存在结果不一致。

对于慢性炎性痛诱发的焦虑样情绪， Yue等[20]的研究发现在C57BL/6小鼠右侧足底注射10 μL CFA 7 d后，模型小鼠在旷场中央区停留时间和高架十字迷宫开放臂停留时间显著降低，出现了焦虑样情绪。Jiang等[21]在ChAT小鼠左侧足底内注射50 μL的CFA，在模后28 d观察模型小鼠中央区距离和时间减少以及进入开放臂的次数和时间减少。Pitzer等[22]人研究发现，在C57BL/6N小鼠右侧足底注射20 μL CFA后14 d，雌性小鼠在开放臂停留时间减少，而雄性小鼠未发现该行为变化。另有研究对SD大鼠采用同样的造模方法，发现模型大鼠在28 d和29 d时，在旷场中，中央区距离，进入中央区次数以及停留时间明显减少，在高架O迷宫中进入开放臂次数和时间明显减少，出现了焦虑样情绪[23]。这些结果并不一致，而且往往很难比较，这些矛盾可能与动物的品系、性别、年龄、造模位置、药物剂量以及生存环境均相关。本实验在检测大鼠焦虑样情绪时选用OF、EZM、NSF、MBT这些经典行为学范式，除MBT可重复多时间测试外，其余均只进行一次，以避免形成空间记忆，影响实验结果。考虑到大多数报告阳性结果的研究是在诱导慢性疼痛至少四周后进行[24]，故只能观察一次的行为学在本实验中均从模后28 d开始进行。研究发现，在模后28 d，OF实验中模型对照组大鼠中央区运动距离、中央区停留时间和中央区进入次数显著减小；模后29 d，EZM实验中模型对照组大鼠开放臂运动距离、开放臂停留时间、开放臂进入次数显著减小；模后30 d，NSF实验中模型大鼠摄食潜伏期显著增加；模后31 d，MBT实验中模型大鼠埋球数量显著增加；这些结果均显示慢性炎性痛大鼠出现了焦虑样行为。而在模后12 d和20 d，MBT中模型大鼠较空白大鼠并未表现出明显的焦虑样行为。结果表明，本实验中CFA诱发的慢性炎性痛模型大鼠，在2 ～ 3周时并未表现出明显的焦虑样情绪，而在4周以后出现明显的焦虑样情绪。提示慢性炎性痛模型大鼠可能需要至少四周的时间才能诱发出与疼痛相关的不良情绪。

对于慢性疼痛诱发的抑郁样情绪， Yalcin等[11]在神经病理痛小鼠上进行系统的研究，发现模后6 ～ 9周时模型大鼠出现抑郁样情绪。而Grégoire等[25]通过单侧跟骨关节内注射50 μL弗氏完全佐剂建立慢性炎性痛模型，发现在模后21 d模型大鼠糖精偏好度减少。故本实验在慢性炎性痛模型大鼠模后17，25和35 d多时间点进行糖水偏爱实验，发现相较于空白对照组大鼠，模型对照组大鼠糖水偏爱度并未出现明显下降，该结果显示5周的慢性炎性痛大鼠仍未能诱发出现抑郁样情绪。对该不一致结果，我们猜测有以下几种可能：(1)本研究中1%的糖水不及糖精甜度高，未能引出明显的偏好差异。(2)本研究的造模方法引起的疼痛程度还不足以在5周时诱发抑郁样情绪。

综上，本实验通过一系列多种经典的行为学范式，研究发现CFA诱发的慢性炎性痛会引起大鼠情感功能的退化，产生一系列负性情绪，这些负性情绪会随着时间的推移而出现，其情绪改变至少需要4周的观察，且抑郁样情绪可能比焦虑样情绪更晚出现。同时本研究还为痛情绪的研究提供合适的动物模型，为痛情绪的进一步研究提供一定的参考价值。