微波辅助离子液体提取黑豆皮花青素的研究

苏 适，马 瑞，董立强，李 月，朱 桐，李键铭

(绥化学院 食品与制药工程学院，黑龙江 绥化 152061)

黑豆属一年生草本植物，为豆科植物种子，其中富含蛋白质、纤维素、维生素、碳水化合物和矿物质等营养成分[1].黑豆种皮中富含的花色苷具有抗氧化，抗突变，预防心血管疾病、清除自由基和改善视力等活性[2-5]，因此，对花青素的提取及应用的研究也越来越多.目前，花青素来源主要是从天然植物原料中获取.

离子液体是由有机阳离子和无机阴离子构成的在室温下呈液态的绿色有机溶剂，具有溶解性好、极性强、稳定性好及黏度范围可调节等特殊优点，在天然产物提取领域应用越来越广泛[6-8].微波辐射提取是利用电磁场的作用使样品中的某些有机物成分与基体有效的分离，并能保持分析对象的化合物状态不被破坏，保持成分的原有状态[9-10].微波辅助提取法具有效率高、提取时间短、对环境友好等特点.本文首次采用离子液体的乙醇溶液为新型溶剂，与微波辅助提取技术结合从黑豆皮中提取花青素，通过单因素结合响应面试验优化提取工艺，为花青素提取工艺革新及及相关产品的应用研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

药材：黑豆，采购于黑龙江省绥化市.

原花青素标准品(质量分数 98 %)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-丁基-3-甲基咪唑氯([BMIM]Cl)：阿尔法试剂有限公司；其他试剂均为分析纯.

1.2 试验仪器

MAS-3微波提取器，上海新仪微波化学科技有限公司；Alpha1502紫外分光光度计，上海谱元仪器有限公司；DFY-200C高速万能粉碎机，上海皓庄仪器有限公司.

1.3 实验方法

1.3.1 标准曲线

称取10 mg原花青素标准品，配成0.1 mg/mL的标准品溶液.分别移取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL标准品溶液置于10 mL的容量瓶中，加入5.00 mL 显色剂(2.5 mL的0.01 g/mL香草醛甲醇溶液和2.5 mL 的8%的盐酸甲醇溶液)，用1%的盐酸甲醇溶液定容，恒温水浴 30 min，花青素在530 nm波长处有最大吸收峰，在此波长下测出待测溶液的吸光度值.以花青素浓度为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，线性拟合方程为Y=0.962 0X+0.006 7，(R2=0.996 4).

1.3.2 黑豆的预处理及花青素的提取

黑豆清洗干净后于60 ℃烘箱干燥，人工去皮，用高速多功能粉碎机粉碎后过60目筛，得黑豆皮粉末.以离子液体的乙醇溶液为溶剂，将一定量的黑豆皮粉放入微波提取器中，提取10 mim，结束后，将提取液离心30 min，取上清液备用.

1.3.3 花青素提取量的测定

取1.0 mL上清液于25 mL 容量瓶内定容，在530 nm 处测定吸光度，计算提取液中花青素提取量.

其中：C为花青素质量浓度(μg/mL)；V为定容体积(mL)；n为稀释倍数；m为质量(g).

1.4 花青素提取的单因素实验

取黑豆皮粉末0.5 g，微波辅助离子液体法提取黑豆皮花青素，考察微波功率(200、250、300、350、400、450 W)、离子液体浓度(0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol/L)、料液比(1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30)对花青素提取量的影响.

1.5 响应面试验设计

根据Box-Behnken Design方法设计试验(表1).根据单因素试验结果，以微波功率(A)、料液比(B)、离子液体浓度(C)为自变量，黑豆皮花青素收率为响应值量(Y)，优化提取工艺，以花青素的提取量为响应值，建立黑豆皮花青素提取工艺优化的二次模型，以确定微波辅助离子液体法提取花青素的最佳工艺条件.

表1 响应面试验设计

2 试验结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 浸泡时间对提取量的影响

由图1可知，浸泡时间会影响黑豆皮中有效成分的溶出量，因此，实验考察了不同浸泡时间(10、20、30、40、50、60 min)对黑豆皮花青素提取量的影响.取1.00 g 黑豆皮粉末浸泡于20 mL 离子液体的乙醇溶液中.实验结果如图1所示，在浸泡时间试验设定范围内，花青素的提取量随时间的延长而增大，当浸泡时间超过 50 min后，提取量没有明显变化.可能是花青素与溶质之间的扩散传质作用达到了平衡，花青素不再继续溶出[11]，提取量没有显著变化.所以，综合考虑响应面法试验设计方案，黑豆皮粉末浸泡时间选择50 min.

图1 浸泡时间对提取量的影响

2.1.2 离子液体浓度对提取量的影响

由图2可知，在离子液体浓度试验设定范围内，花青素的提取量也随着[BMIM]Cl 浓度的增加先增大之后降低，当[BMIM]Cl 的浓度达到1.0 mol/L时，花青素提取量达最大.原因可能是当[BMIM]Cl 的浓度增加时，离子液体对花青素的溶解性能增强，但离子液体的黏度也随之增大，溶剂的扩散能力降低，提取的花青素不易扩散到溶液中[12]，其他杂质成分的溶出量也同时增多.所以，综合考虑响应面法试验设计方案，离子液体浓度选择1.0 mol/L.

图2 离子液体浓度对提取量的影响

2.1.3 微波功率对提取量的影响

由图3可知，在微波功率试验设定范围内，花青素提取量随着功率的增强先增大后下降，花青素的提取量在功率为400 W时达到最大.微波辐射功率增强时，辐射能会加大溶剂分子对样品基体的渗透能力，产生的压力能够破坏细胞壁，有利于花青素的溶出[13-14].当微波的功率超过400 W 时，微波产生的局部升温过快可能会容易造成不稳定的目标提取物降解.所以，微波功率选择 400 W进行试验.

图3 微波功率对提取量的影响

2.1.4 料液比对提取量的影响

由图4可知，在料液比试验设定范围内，花青素提取量随着料液比的增大先增加后降低，当料液比达到1∶20时花青素的提取量达到最大.这可能是由于增加提取溶剂的体积使得样品与提取溶液充分接触，提取到的目标产物随之越多；当料液比继续增加时，样品中的其他成分的溶出量也会增大，花青素的提取率降低[15-16].所以，响应面法试验设计方案中，最佳的料液比为 1∶20.

图4 料液比对提取量的影响

2.2 响应面结果分析

2.2.1 数学模型预测及和验证

经软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到黑豆皮花青素得率(Y)的回归模型为得到二次回归拟合方程Y=4.13+0.045A+ 0.081B+0.13C+0.029AB-0.059AC-0.094BC-0.45A2-0.41B2-0.20C2

表2 回归分析结果

由表3方差分析结果得到，P<0.000 1，说明模型达到极显著水平；失拟值P=0.784 9>0.05，模型不显著，说明非试验因素对试验结果的影响不大.该模型决定系数R2=0.993 7，表明该模型99.37%的响应面变化可以通过拟合模型来解释，试验误差小，可用于黑豆皮花青素提取工艺的优化.回归方程各项方差分析表明，单因素的影响大小为C>B>A，即离子液体浓度>料液比>微波功率.回归模型一次项 B、C(P< 0.01)为模型极显著因素，二次项 A2、B2、C2(P< 0.01)对结果影响极其明显，交互项 AC(P<0.05)对结果影响显著.

表3 方差分析表

注：P>0.05为不显著；P<0.05为显著；P<0.01为极显著

2.2.2 响应面分析

响应面和相应的等高线图能最直观地反映任意两个因素交互作用与响应值的作用关系.如果响应曲面较陡峭，等高线越近似椭圆，说明该因素响应值受变量交互作用显著；反之则说明交互作用关系越弱，对响应值的影响越不显著[17].由图5可得到结论：微波功率与料液比交互作用影响较小，料液比与离子液体浓度、微波功率与离子液体浓度交互作用影响较大，与方差分析结果一致.

图5 各因素交互作用的响应面图

2.2.3 验证试验

通过上述响应面试验分析，得出黑豆皮花青素的最佳提取条件：离子液体浓度1.06 mol/L，微波功率406.09 W，料液比1∶20.33，理论预计值4.155 mg/g.综合考虑，将工艺条件修正为离子液体浓度1.0 mol/L，微波功率400 W，料液比:1∶20，在优化条件下实际测得花青素提取量为4.146 mg/g，相差 0.22%，说明此模型准确可靠，可利用响应面法对黑豆皮花青素的提取工艺进行优化.

3 结 语

本试验采用微波辅助离子液体法提取黑豆皮中的花青素，通过采用Box-Benhnken中心组合试验原理设计及优化，优化最佳工艺条件：离子液体浓度1.0 mol/L，微波功率400 W，料液比1∶20.在此条件下，花青素提取量为4.146 mg/g.离子液体具有可设计性、溶解性强，可以对中药中的复杂成分进行选择性提取，提取过程快速高效、操作便捷和环境友好等特点，在中药提取领域具有广阔的前景.本文采用微波辅助离子液体提取黑豆皮中花青素，该工艺提取时间短，操作简单，避免溶剂挥发，可为开发天然色素的研究提供理论依据.