AISPPs对木瓜蛋白酶的抗冻保护作用研究

田 野，李亚楠，吴 征，陈 强，曲 敏

(哈尔滨商业大学 食品工程学院 黑龙江省普通高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076)

冰结构蛋白(ice structuring proteins, ISPs)，又称不冻蛋白、抗冻蛋白，是一类由某些鱼类、昆虫、植物、真菌和细菌为抵御外界环境应激反应所产生的多肽，能够有效地抑制冰晶生长的蛋白[1].它具有一定的热滞活性，即能够以非依数性方式降低溶液的冰点，但对熔点影响甚微，使溶液冰点和熔点之间出现差值[2].其中，植物源ISPs与动物源ISPs相比具有来源广泛、价格低廉等特点，自1992年以来成为研究的热点[3-4].

木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类含巯基肽链的内切酶，广泛存在于番木瓜(Cariea papaya)的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最为丰富[5].它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品[6]、医药[7]、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用[8].木瓜蛋白酶最适温度为55～60 ℃，在低温条件下，酶和底物的结合速率减慢，且木瓜蛋白酶中的肽链收缩，不易与底物嵌合，酶活降低.

本课题组利用冰与冰结构蛋白特异性结合法提取AISPs[9]，并将其应用于冷冻面团[10]、速冻饺子皮[9]等方面，发现AISPs对其具有明显的保护作用.但木瓜冰结构蛋白酶肽(Allium ice structural proteins peptide,AISPPs)的抗冻保护作用未见报道，故本试验将AISPPs加入木瓜蛋白酶中，探究其对木瓜蛋白酶的抗冻保护作用，以酶活性作为主要的功能性评价指标，并对其冻干保护机理进行初步探讨，以期拓宽AISPPs的应用.

1 材料与仪器

1.1 实验材料

“肇东”紫花苜蓿，由黑龙江省农业科学院草业研究所苜蓿实验基地提供.Na2HPO4，NaH2PO4，乙醇，硫酸铵，丙酮，EDTA-2Na，氢氧化钠，考马斯亮蓝G-250，邻苯三酚，SOD，所有试剂均为分析纯.标准蛋白酶液，生化试剂.

1.2 实验仪器

电子天平，沈阳龙腾电子秤量仪器公司；TGL-16型高速台式离心机，上海医疗器械六厂；721型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；DHP-9162型光照培养箱，上海一恒科技有限公司；GW-06A电热恒温干燥箱，哈尔滨仪器五厂；ESJ 180-4型分析天平，沈阳龙腾电子秤量仪器公司；粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；BCD-247-C型电热恒温水浴锅，聚创环保设备有限公司.

1.3 冰结构蛋白的制备

参照曲敏[9]的方法，取苜蓿草粉以1∶20的料液比在磷酸缓冲溶液，磁力搅拌器搅拌、浸泡2 h，8层纱布及滤纸过滤，弃去草渣，上清液于5 000 r/min离心15 min，得可溶性蛋白的粗提液，采用考马斯亮蓝法测定粗提液中蛋白含量，计算质量,记为m1.

将蒸馏水注入圆球形冰槽，在-18 ℃冰箱冷冻，制成直径为1 cm的冰球，备用.在上清液中加入冰球，于-18 ℃静置，以冰球吸附上清液中的AISPs.2 min后，分离出冰球并待自然融化，测量溶液中蛋白含量，计算质量为m2.最后将融化后的液体装入旋转蒸发仪进行旋转蒸发浓缩，得到的浓缩液即为AISPs溶液.

1.4 标准曲线的测定

参照叶婧[11]的方法，采用考马斯亮蓝染料比色法，分别取0、10、20、30、40、50、60 mg/L牛血清蛋白标准品各1 mL，加入考马斯亮蓝G250溶液5 mL，充分混匀，静置5 min，于595 nm波长处测定吸光值.以牛血清蛋白质量浓度为横坐标，以A595nm为纵坐标，绘制标准曲线.

1.5 酪氨酸标准曲线的测定

本试验采用福林酚试剂法[12]测定酪氨酸标准曲线.分别取1 mL质量浓度为10、20、30、40、50、60 μg/mL的酪氨酸溶液，加入0.5 mL 福林试剂、5 mL 0.4 mol/L Na2CO3均匀混合，于40 ℃水浴锅中放置1 min，于680 nm下测定其吸光度，以空白组为对照，以酪氨酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线.

1.6 AISPPs的制备

用碱性蛋白酶对AISPs进行酶解制备AISPPs，以蛋白水解度(DH)作为考察指标，考察酶解时间、底物质量浓度、酶质量分数、溶液pH、酶解温度其酶解程度的影响.

1.6.1 酶解时间

酶解温度55 ℃，反应体系的pH为8.0，碱性蛋白酶质量分数为5%条件下分别酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，比较不同酶解时间对AISPs的水解程度.

1.6.2酶质量分数的影响

酶解温度55 ℃，反应体系的pH为8.0条件下，分别加入质量分数2%、3%、4%、5%、6%、7%的碱性蛋白酶，酶解2.5 h，比较不同酶质量分数对AISPs的水解程度.

1.6.3 酶解pH的影响

酶解温度55℃，碱性蛋白酶质量分数为5%条件下，分别调节反应体系的pH为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，酶解2.5 h，比较不同酶解pH对AISPs的水解程度.

1.6.4酶解温度的影响

反应体系的pH为8.0，碱性蛋白酶质量分数为5%条件下分别于45、50、55、60、65 ℃条件下进行反应，酶解2.5 h，比较不同酶解温度对AISPs的水解程度.

1.6.5 蛋白水解度的测定

本试验采用甲醛滴定法测量蛋白质水解度，取2 mL待测蛋白溶液，分别加入4 mL蒸馏水及酚酞溶液3滴，摇匀后用0.095 35 mol/L氢氧化钠溶液滴至成微红色，然后加入4 mL中性甲醛溶液，摇匀后静置片刻.再用0.095 35 mol/L NaOH溶液滴至成为红色，记下加入甲醛后所消耗的标准氢氧化钠体积.以蒸馏水为对照，水解度按下式计算：

DH%=B(Mb)(1/α)(1/MP)(1/htot)×100%

(2)

其中：B为NaOH的体积，mL；Mb为NaOH的浓度，mol/L；1 /α为在pH 7.0，50 ℃的试验条件下，1 /α为2.26；MP为蛋白质的品质，g；htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，对AISPs蛋白该值取7.40 mmol/g.

1.7 响应面实验

根据单因素实验结果，采用响应面法对碱性蛋白酶对AISPs的水解条件进行优化，选取酶解时间(A)、酶解pH(B)和酶解温度(C)为考察因素，以DH为考察指标，进行响应面试验.见表1.

表1 响应面分析试验设计因素与水平

采用BBD试验设计方法设立17组试验，各因素和响应面值(DH)如表2所示，对数据进行二次回归拟合，分析各因素的效应，最后得到碱性蛋白酶对AISPs的水解条件最佳工艺.

1.8 AISPPs对木瓜蛋白酶的保护作用

1.8.1 不同冻藏时间的比较

取两组木瓜蛋白酶各10 mL，一组加入0.3%的AISPPs，一组为空白对照，于-30 ℃冻藏5、10、15、20、25 d后木瓜蛋白酶活力，比较不同冻藏时间下加入AISPPs对木瓜蛋白酶的保护作用.

1.8.2 不同质量分数AISPPs对木瓜蛋白酶酶活力的影响

取5组木瓜蛋白酶各10 mL，分别加入质量分数为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的AISPPs，于-30 ℃冻藏5 d，测定木瓜蛋白酶活力，比较不同AISPPs对木瓜蛋白酶活力的影响.

表2 碱性蛋白酶对AISPs的水解条件响应曲面试验设计和结果

2 实验结果与分析

2.1 牛血清蛋白标准曲线及AISPs提取率

由图1可知，蛋白溶液的吸光度与质量浓度存在正比例关系，线性关系良好，可用于后续实验.根据标准曲线，通过计算得出AISPs提取率约为37.77%.

图1 牛血清蛋白标准曲线

2.2 酪氨酸标准曲线

由图2可知，酪氨酸标准曲线为y=0.195 1x-0.151 3，线性关系良好，可用于其他待测蛋白质量浓度的测定.根据标准曲线，根据计算碱性蛋白酶的酶活性为9×104U/mg.

图2 酪氨酸标准曲线

2.3 酶解单因素实验

2.3.1 酶解时间

由图3可知，水解度随着酶解时间的增加，呈现先增大后减小的趋势；当酶解时间为2.5 h时，水解度达到最大值为15.3%，蛋白酶基本和蛋白质完全作用，继续水解底物质量浓度会继续减小，随着水解的进行酶的特异性催化位点减少，即水解过程中酶逐渐失活，故最佳酶解时间为2.5 h.

2.3.2 酶解质量分数

由图4可知，水解度随着酶解质量分数的逐渐升高，呈现先增大后减小的趋势.当酶质量分数为1%～ 4%时，酶质量分数的逐渐增加使反应物逐渐达到反应完全，AISPs水解度逐渐增加.当酶解质量分数达到4%时，水解度达到最大值为14.6%.此后再增加酶质量分数，增加了溶液体积，AISPPs被稀释，水解度降低.

图3 酶解时间对水解度的影响

图4 酶质量分数对水解度的影响

2.3.3 酶解pH

图5可知，水解度随着酶解pH的逐渐升高，呈现先增大后减小的趋势.这是由于随着pH的不断增大，AISPs所带的电荷不断增多，蛋白与水之间的相互作用不断增大，蛋白与蛋白之间的相互作用不断减小.当酶解pH达到4时，水解度达到最大值为16.2%.

图5 酶解pH对水解度的影响

2.3.4 酶解温度

由图6可知，水解度随着酶解温度的逐渐升高，呈现先增大，后减小的趋势.当在45～55 ℃时，温度升高可以提高酶的活性，且有利于底物折叠结构的展开，水解度随着温度的增加而增加.当酶解温度达到55 ℃时，水解度达到最大值为16.3%，故最佳酶解温度为55℃.当在55～70 ℃时，此时温度超过了酶的最适宜温度时，酶逐渐失活，导致蛋白质水解度下降.

图6 酶解温度对水解度的影响

2.4 碱性蛋白酶对AISPs的水解条件优化

2.4.1 回归方程的建立与方差分析

利用软件对试验结果进行回归分析，拟合得到水解度的二次元回归方程为：

DH%=16.5+1.61A+0.43B+0.22C+0.16AB+0.34AC+0.14BC-1.05A2-0.25B2-0.98C2

(3)

由表3可知，失拟项不显著，表明模型的拟合程度良好，未知因素对试验结果的干扰较少，模型的方差分析说明该模型已经达到显著水平(P<0.05).由P值可知各因素对碱性蛋白酶对AISPs的水解条件影响为：酶解时间>酶解pH>酶解温度.校正系数R2Adj为0.95、变异系数(C.V.)为2.9%<10%、决定系数R2为0.43，说明多项式模型的利用性和精密度是可行的，通过此模型方程能预测出碱性蛋白酶对AISPs在任何变量值下的水解条件.

表3 碱性蛋白酶对AISPs的水解条回归模型

2.4.2 响应面分析及验证

图7～9是因素(酶解时间、酶解pH、酶解温度)交互影响的响应面图和等高线图.由图7可知，随着酶解时间的增大，碱性蛋白酶对AISPs的水解度呈现先有所增加后缓慢降低的趋势.酶解pH为 4～6时，提取率呈现先增大后减小的趋势；等值线区域水平，表示酶解时间与酶解pH间具有显著的交互作用.由图8可知，随着酶解pH的不断增加，水解度呈现先增大后趋于平稳的趋势；随着酶解温度的逐渐增大，水解度呈现先增大后减小的趋势.由图9可知，随着酶解温度的不断增高，水解率呈现先增大后减小的趋势.

通过二次多项式回归分析求最大值，得到碱性蛋白酶对AISPs的水解条件最佳工艺为：酶解时间为2.817 h，酶解pH为5.221，酶解温度为50.593 ℃，在此条件下DH的理论预测值为16.04%.结合最优工艺参数和实际生产可操作性，对各因素进行修订，最终确定最有工艺为：酶解时间为2.8 h，酶解pH为5.2，酶解温度为50.6.在最佳工艺条件下，经过3次重复试验验证，DH为15.89%，与预测值相近，说明优化工艺重复性良好，最优工艺的结果可靠.

图7 酶解时间和酶解pH对水解条件的交互影响

图8 酶解时间和酶解温度对水解条件的交互影响

图9 酶解pH和酶解温度对水解条件的交互影响

2.5 AISPPs对木瓜蛋白酶的抗冻保护作用

由图10可知，随着冷冻天数的逐渐延长，木瓜蛋白酶的酶活力逐渐降低，但加入AISPPs可明显缓解低温对其的损害.当冷冻时间为25 d时，对照组木瓜蛋白酶酶活性为2.8×105U/mg；而实验组木瓜蛋白酶酶活性为4.1×105U/mg，相比对照组酶活性提高了46.43%.因此，添加AISPPs对木瓜蛋白酶活力具有一定的保护作用.随着冷冻时间的延长，一方面，木瓜蛋白酶溶液中水分开始结晶,蛋白酶分子侧链在冰晶的挤压下发生聚集，其周围的游离水分子因重排布而失去复水力，逐渐导致木瓜蛋白酶变性;另一方面，未冻结时，部分木瓜蛋白酶分子以高度水化的折叠状存在，非极性基团相互作用形成非极性键，因为位于酶分子内部而避开与水分子的接触，所以状态比较稳定；但温度降低时，冰晶的形成使木瓜蛋白酶水化程度降低，致使蛋白酶分子展开变性[13].而AISPPs能吸附于冰晶表面，介于木瓜蛋白酶分子和水分子之间，阻止水与冰的接触，从而抑制冰晶生长，改变冰晶形态，抑制冰晶重结晶[14]，从而减缓了冰晶对木瓜蛋白酶的伤害.

图10 冷冻时间对木瓜蛋白酶活力的影响

2.6 AISPPs添加量的确定

由图11可知，随着添加AISPPs质量分数的增加，木瓜蛋白酶的酶活力呈现先增高后减小的趋势.当AISPPs质量分数为0.5%时，木瓜蛋白酶活力达到最高值6.3×105U/mg.Carpenter J F等[15]发现ISPs相对质量分数较低时可显著提高红细胞的存活率；而较高质量分数将致使红细胞的存活率降低.其原因是ISPs具有双重效应，当质量分数较低时，具有抑制大的冰晶形成的作用，表现出对细胞膜的保护；而当质量分数较高时，ISPs进入磷脂双分子层，破坏其结构引起渗漏，影响了其与冰晶亲和作用强度，促进了大冰晶的形成，成为细胞膜毒害剂[3].说明适宜的质量分数决定了其抗冻保护作用，而AISPPs的最适添加量为0.5%.

图11 冰结构蛋白质量分数对木瓜蛋白酶活力的影响

3 结 语

本文利用冰结合磷酸缓冲液提取法提取AISPs，并用碱性蛋白酶对其进行酶解.通过单因素及响应面法对AISPs的水解条件优化，优化结果为酶解时间为2.8 h，酶解pH为5.2，酶解温度为50.6 ℃.在最佳工艺条件下，经过3次重复试验验证，AISPs的DH%为15.89%，水解后得到苜蓿冰结构蛋白肽，探究AISPPs对木瓜蛋白酶活力的影响.于-30 ℃冻藏5 d条件下，发现加入AISPPs可提高木瓜蛋白酶活力；当冷冻时间为25 d时，对照组木瓜蛋白酶酶活性为2.8×105U/mg，实验组木瓜蛋白酶酶活性为4.1×105U/mg，相比对照组酶活性提高了46.43%.比较质量分数为0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%的AISPPs对木瓜蛋白酶活力的影响，发现AISPPs为0.5%时，木瓜蛋白酶活力达到最高值6.3×105U/mg.