定志散对抽动症小鼠多巴胺和刻板行为的影响

单麒元，刘 琳，孙 竺，徐静东

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

抽动-秽语综合征(Tourette’s syndrome , TS)是一种儿童期发病可延续至青春期，通常伴有运动和行为异常的慢性神经精神障碍性疾病[1].目前国内治疗TS的药物最普遍的是多巴胺(Dopamine, DA)受体阻断剂，例如硫必利等.但是长期使用无论是治疗效果还是副作用均显示出其局限性.

中医认为TS的发病机制是患儿神伤气乱，心气亏虚[2].安神定志丸是《和剂局方》中一种临床常用的养心安神方剂.本实验的定志散源于《和剂局方》的安神定志丸，定志散选用人参、茯苓、远志、石菖蒲四味中药.人参配伍茯苓，益气养心；石菖蒲配伍远志，定志开窍；远志配伍茯苓，交通心肾.诸药合用益心气，开心窍，安心神.

TS患者临床主要表现为不自主眨眼、面部肌肉抽动做怪相、缩鼻、耸肩、摇头及秽语等[3].本实验在造模后进行笼边观察，研究定志散对TS小鼠刻板行为的影响.单胺类神经元轴突可以影响大脑中每一个脑区，其中含DA量占比最多，许多研究认为TS的发病机制和DA有关[4-5]，所以本实验检测造模21 d小鼠脑匀浆中含DA量并与刻板行为相印证，来研究定志散对TS模型鼠的防治效果.

1 实验材料

1.1 实验动物

清洁级ICR小鼠48只，雌雄各半，6～8周龄，体重(20±2)g.由长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，批号：201900027072.

1.2 实验药品

亚氨基二丙腈(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，批号：AV54D-EQ);盐酸硫必利片(天津中新药业集团股份有限公司，批号：36180304);定志散(由哈尔滨商业大学药学院提供).

1.3 实验仪器

ZZ-6小鼠自主活动测试仪(型号：ZZ-6 厂家：成都泰盟科技有限公司);电子分析天平(型号：FA-1004B 厂家：上海跃平科学仪器有限公司);高效液相色谱仪(型号：e2695 厂家：Waters);医用低温箱(型号：MDF-193 厂家：Panasonic)

2 实验方法

2.1 制备定志散混悬液

处方：人参15 g、茯苓15 g、远志10 g、石菖蒲10 g.分别配制高剂量组定志散悬浊液(0.3 g/mL)、中剂量组(0.15 g/mL)、低剂量组(0.075 g/mL)，放入4 ℃冰箱待用.

2.2 实验动物分组及复制抽动-秽语综合征模型

取小鼠48只，按0 d自主行为成绩随机分为空白组(n=8)、模型组(n=8)、阳性药组(n=8)、高剂量组(n=8)、中剂量组(n=8)、低剂量组(n=8).将亚氨基二丙腈(3,3'-Iminodipropanenitrile, IDPN)用生理盐水稀释成质量浓度为30 mg/mL的溶液，按0.3 g/kg剂量通过腹腔注射给药；空白组给予腹腔注射等量的生理盐水，每天1次持续注射21d.

2.3 实验动物给药

每日取出定志散悬浊液，低、中、高剂量组分别按1.2、2.4、4.8 g/kg灌胃.阳性药组按10g/kg给予硫必利片混浊液.空白组、模型组给予等量的蒸馏水灌胃，持续灌胃21d.

2.4 刻板行为指标检测

2.4.1 点头次数测定

将小鼠分别置于29 cm×18 cm×15 cm的观察笼中，先适应环境1 min后人为记录其1 min内点头次数，测试完毕后清洁笼内排泄物，以消除对下一组小鼠的影响.造模后每7天检测1次，一共3次.

2.4.2 分类刻板行为评估

将小鼠分别置于29 cm×18 cm×15 cm的观察笼中，先适应环境1 min后人为记录其1 min内旋转、自咬、摆头、捋毛、舞蹈样运动、啮咬出现次数，测试完毕后清洁笼内排泄物，以消除对下一组小鼠的影响.造模后第21d测试.

2.5 脑中含多巴胺量测定

2.5.1 组织样本制备

将小鼠麻醉后，立即断头处死，分开颅骨，在冰盘上快速取脑，去除脑干及小脑，置0～4℃生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，脑组织右侧半球，置于液氮中保存.后将待测脑组织从液氮中取出，精密称重，迅速放入预冷的玻璃匀浆器中，加入重量体积比(1∶1)的冰冷生理盐水，0～4 ℃条件下快速匀浆.组织被均匀粉碎后在恒温下进行离心(2 000 r/min，10 min，4 ℃)，取上清液待测.

2.5.2 检测条件

1)色谱分析条件

色谱柱采用Agilent C18反相色谱柱(4.6×150 mm, 5 μm)，流动相为水相(每1L 中含辛烷磺酸钠2.5 g，磷酸二氢钠12 g，乙二胺四乙酸36 mg，氯化钠1.17 g，pH=3.3)∶甲醇∶乙腈=78∶19∶3，使用前经0.22 μm微孔滤膜负压滤过，并超声脱气15 min.流速为1mL/min，柱温35 ℃；电化学检测器工作电极为玻璃碳电极，参比电极为银/氯化银(Ag/AgCl)电极，工作电压为0.8 V，灵敏度：50 nA.

2)小鼠脑匀浆样品预处理

取小鼠脑匀浆液50 μL，加入200 μL乙腈，涡旋混匀沉淀蛋白，再将混匀后的液体离心10 min(12 000 r·min-1)，吸取上清液氮气吹干，加50 μL流动相，涡旋5 min，离心10 min(12 000 r·min-1)取上清液，进样20 μL，进行HPLC分析.

2.5.3 高效液相电化学分析方法学验证

1)专属性考察

精密吸取多巴胺对照品，20 μL进样，记录色谱图.

2)线性关系考察

精密称取 DA 5 mg，用蒸馏水溶解定容5毫升容量瓶中,DA质量浓度：1 mg·mL-1，再从中取10 μL，得质量浓度为1 μg/mL，从中精密吸取6.0 mL，置10 mL量瓶中，后逐步稀释，得质量浓度分别为20、40、80、150、300、600 ng·m L-1标准稀释液.计算峰高(Y)与质量浓度(X)的线性回归方程.

3)精密度考察

分别配制低(100 ng·mL-1)、中(300 ng·mL-1)、高(500 ng·mL-1)3种不同质量浓度的混合对照品溶液，分装后贮存于-80 ℃冰箱内.日内连续测3次，计算日内精密度；每份样本每日测1次，连续测定3日，计算日间精密度.

4)回收率考察

相对回收率：混合对照品稀释液100、300、500 ng·mL-1分别连续进样3次，以实测的质量浓度(由标准曲线求出各样品的质量浓度)与混合对照标准品溶液质量浓度之比来计算相对回收率.

5)稳定性试验

取供试品溶液，分别于24 h、30 d进样20 μL，计算各组分峰面积积分值(RSD值).

2.6 统计学处理方法

3 实验结果

3.1 刻板行为指标检测

3.1.1 点头刻板行为检测

小鼠点头刻板行为次数显示，与空白组相比，模型组14 d的点头刻板行为次数显著增加(P<0.05)，模型组21 d点头刻板行为次数非常显著增加(P<0.01).与模型组相比，14 d阳性药组点头次数显著降低(P<0.05)，21 d低剂量组和阳性药组点头次数显著降低(P<0.05)、高剂量组点头次数非常显著降低(P<0.01).见表1.

表1 小鼠点头刻板行为次数次)

注：与空白组比较，*P<0.05有显著性差异，**P<0.01有非常显著性差异；与模型组比较，△P<0.05有显著性差异，△△P<0.01有非常显著性差异

3.1.2 分类刻板行为检测

与空白组相比，模型组的舞蹈样次数显著增加(P<0.05),旋转、自咬、摆头次数非常显著增加(P<0.01).与模型组相比，阳性药组的舞蹈样次数显著增加(P<0.05),自咬和摆头次数非常显著增加(P<0.01)；低剂量组的摆头和舞蹈样次数显著增加(P<0.05)自咬次数非常显著增加(P<0.01)；中剂量组摆头次数显著增加(P<0.05)；高剂量组舞蹈样次数显著增加(P<0.05)自咬和摆头次数非常显著增加(P<0.01).见表2

表2 小鼠分类刻板行为检测次)

注：与空白组比较，*P<0.05有显著性差异，**P<0.01有非常显著性差异；与模型组比较，△P<0.05有显著性差异，△△P<0.01有非常显著性差异

3.2 高效液相-电化学法测小鼠脑匀浆中含多巴胺量结果

3.2.1 方法学验证

3.2.2 小鼠脑匀浆中含多巴胺量测定结果

与空白组比较，模型组小鼠脑中含DA量显著降低(P<0.05)；与模型组比较，高剂量组和阳性药组的小鼠脑中含DA量显著升高(P<0.05).见表3.

表3 小鼠脑中含DA量

注：与空白组比较，*P<0.05有显著性差异；与模型组比较，△P<0.05有显著性差异

4 讨 论

现今临床使用的治疗TS药物疗程长、靶向性不强、患儿长期使用常出现嗜睡、胃肠道反应，故临床依从性差[7-8].中医认为TS的发病机制是小儿为稚阴稚阳之体，形气未充，神气怯弱，易为外界刺激而干扰脏腑正常生理功能.暴受惊吓而致神伤气乱，使心无所依，神无所归；思虑过度而使心脾损伤，心气亏虚，运化不利；小儿所愿不遂，娇宠纵若，稍有不顺，则易恼怒，致肝气郁结，疏泄失职，郁久化火，热极生风，致肝风内动，风阳上扰清窍，出现肢体和头面部肌肉抽搐，或拧眉眨眼，或努嘴耸肩[9].定志散来源于宋代《和剂局方》中临床常用的一种安心养伤方剂定志丸.人参配伍茯苓，益气养心；石菖蒲配伍远志，定志开窍；远志配伍茯苓，交通心肾.诸药合用益心气，开心窍，安心神.所以在本实验中，选用定志散来研究其对TS的治疗效果.

TS是一种慢性、多发性、波动性伴有肌肉抽搐，伴或不伴有不自主发声的精神性障碍疾病.动物复制TS模型时，刻板行为的变化是最明显的表现.有文献记载当TS鼠运动极度活跃、其刻板行为包括持续互相捋毛、挖掘、撕咬、跳跃并伴有步伐缺陷[10-11].在前期预实验中发现，用IDPN诱导的TS模型鼠的点头刻板行为最为典型且和临床TS患者症状相似，所以本实验每隔7天检测一次点头刻板行为，研究定志散对TS模型鼠刻板行为的影响效果.实验中各组模型鼠在15 d后逐渐出现的行为学的改变且逐渐增多，造模第21 d模型鼠刻板行为最为明显且安全性较好，所以本实验在21d进行分类刻板行为评估，然后处死小鼠测其脑匀浆中含DA量.

DA系统包括：黑质-纹状体，中脑边缘，中脑皮质，漏斗结节四个部分.现今许多学者以皮质-纹状体-丘脑-皮质回路中DA神经递质失衡作为TS发病机制的主流研究方向[12].有学者认为TS的发病机制或是DA的低毒性堆积引起[5]，或是多巴胺转运体的超敏感[13-14]，或是多巴胺D1受体的超敏感[7]，或是多巴胺D2受体的抑制[3]等猜测.所以本实验在21d各组TS模型鼠刻板行为最明显的时候集体处死，用高效液相-电化学法测脑匀浆中含DA量.

刻板行为检测结果发现21d低、中、高剂量定志散组均能减少改善TS模型鼠的刻板行为，其中低剂量和高剂量显著减少(P<0.05).含DA量测定结果发现，与空白组相比，TS模型组鼠的脑中含DA量显著减少(P<0.05).持续灌胃21d定志散后，TS模型鼠脑中含DA量都有回升的趋势且低、中、高剂量三组鼠的脑中含DA量有递增趋势，其中高剂量定志散组的脑中含DA量显著增加(P<0.05).所以能初步得出结论:定志散对TS进行有效的防治作用且稳定.

另外，在刻板行为检测实验中发现，与模型组相比，只有定志散低剂量组和高剂量组的刻板行为有显著减少(P<0.05),但是中剂量组没有显著性差异.而在含DA量测定实验中，只有定志散高剂量组显著提高脑中含DA量.本实验定志散的君药是人参，有研究发现人参皂苷可以提高神经兴奋性传递的同时，也可拮抗兴奋性神经的毒素起到保护作用[15].猜测可能与人参皂苷对兴奋神经的双向调节有关，这也和TS的发病机制是DA神经的低毒性堆积引起的假说[5]相符合.提示后期可以改变处方中人参的处方量，研究人参皂苷对兴奋性神经的双向调节对TS治疗效果的影响，寻求一个最佳的人参给药处方量.