一例鸡马立克氏病与沙门氏菌病混合感染的实验室诊断

刘奉明， 袁治祥， 温贵兰，3， 张太前， 覃廷玉， 田碧霞，邓华成， 张太华， 冷玉霞， 汪德生，3*

(1. 贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025； 2. 贵州省思南县动物疫病预防控制中心，贵州 思南 565100；3. 贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)

1 流行病学调查及症状

2019年6月28日，思南县某养殖专业合作社购进1日龄脱温鸡苗500羽，65日龄开始发病。病初出现瞌睡，拉黄白色粪便(呈米汤样)，脱毛，消瘦。发病数150余只，发病率30%(150/500)，后陆续出现死亡，至送检时已死亡63只，病死率42%(63/150)，病程10天左右。曾用头孢噻呋钠、氟苯尼考、磺胺甲氧吡嗪、土霉素及白头翁等药物治疗，但效果不好。该养殖场已先后进行过新城疫、传染性支气管炎、鸡痘、传染性法氏囊病、禽流感疫苗免疫。

2 病理变化

对病鸡进行剖检，可见肺部结节，小肠出血，胸部皮下有粟粒大小的黄色颗粒结节，心脏表面有白色结节。坐骨神经未观察到病变。

3 实验室检测

3.1 细菌分离培养与鉴定无菌操作取病死鸡肝脏划线接种鲜血琼脂培养基， 37 ℃培养24 h观察， 可见在鲜血琼脂培养基上生长出光滑、边缘整齐、湿润、微隆起、露滴状的小菌落。挑取菌落经革兰氏染色镜检为革兰氏阴性短小杆菌。取纯培养物分别接种生化试验培养基，结果与沙门氏菌生化特性相符(见表1)。鉴定为沙门氏菌。

3.2 马立克氏病病毒(MDV)抗原抗体检测采集病鸡羽髓8份加入适量PBS液，捣碎，冻融3次后离心，上清液作为马立克氏病待检抗原。采集病鸡血液12份经3 500 r/min离心，上清液作为马立克氏病待检血清(抗体)。分别与马立克氏病标准血清、标准抗原进行琼脂扩散试验，结果有6份待检抗原、5份待检血清与马立克氏病标准血清、标准抗原出现白色沉淀线，表明有MDV感染。

表1 分离菌生化试验

注：+为阳性反应，-为阴性反应

3.3 马立克氏病病毒、禽白血病病毒(ALV)核酸检测采集病鸡肝脏和脾脏混合，按照生工生物工程(上海)股份有限公司生产的基因组RNA快速抽提试剂盒说明书进行总RNA的提取，按照康为世纪生物科技有限公司生产的HiFi-Script cDNA 第一链合成试剂盒说明书合成cDNA。分别用ALV-A/B/J和MDV 4对特异性引物对核酸样本进行PCR扩增，总体积20 μL。反应体系：EsTaqMix 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上游引物(F) 1.0 μL，下游引物(R) 1.0 μL，ddH2O 6.0 μL。引物序列见表2。扩增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。预扩增大小：ALV-A 715 bp，ALV-B 515 bp，ALV-J 422 bp，MDV 522 bp。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。 2份病料中均检测出MDV核酸；9份病料中未检测出ALV核酸。

表2 引物序列

4 结果

通过对发病鸡现场观察与剖检、实验室检测到鸡马立克氏病病毒和沙门氏菌，诊断造成本次鸡发病死亡的主要原因是马立克氏病与沙门氏菌病混合感染。

5 讨论

5.1鸡马立克氏病 (Marek’s disease， MD) 是鸡的1种淋巴组织增生性疾病，以外周神经、性腺、虹膜、各内脏器官、肌肉和皮肤等单个或多个组织器官发生单核细胞浸润为特征。该病是由细胞结合性疱疹病毒引起的传染性肿瘤病，病鸡常见消瘦、肢体麻痹，并常有急性死亡[1]。沙门氏菌常引起鸡白痢，雏鸡通常表现全身急性感染，成年鸡则以局部和慢性感染为主，可造成严重经济损失，有的鸡群死亡率可达到100%[2]。

5.2鸡马立克氏病的免疫通常在刚出壳时(1日龄)进行，但其产生抗体需要一段时间(至少7日龄以上)，因此存在1个免疫空白期。在此期间一定要加强环境消毒，以免被野毒感染而导致发病。马立克氏病是1种肿瘤消耗性疾病，无治疗价值，一旦感染只能采取淘汰处理。

5.3鸡马立克氏病和禽白血病有很多相似之处，临床上都表现消瘦、肿瘤，大部分鸡发生马立克氏病后期肿瘤结节都会突出实质器官的表面，而禽白血病出现这种情况的概率较少，但确定性鉴别诊断还需通过实验室病原核酸检测。