青钱柳总黄酮的提取工艺优化及体内外活性研究*

袁中文，陈苏静，林泽敏，陈连娣，梅峥嵘，王颖

(1.广州医科大学附属第三医院药剂科，广州 510150；2.广州中医药大学中药学院，广州 510006)

青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja]为胡桃科青钱柳属落叶乔木，树叶具有生津清热、降血压、降血糖、降血脂等功效[1]。青钱柳叶主要含多糖、黄酮及三萜类等化学成分[2-3]，药理活性方面的研究表明，青钱柳叶具有降血糖、降血脂、抗脂质过氧化等药理活性[4]。目前针对青钱柳叶活性成分的研究多数集中在多糖部分，对黄酮类成分的研究相对较少。本研究以单因素实验结果为基础，首次采用Box-Behnken 设计-响应面法结合层次分析的方法优化青钱柳黄酮的回流提取工艺，以提取物得率，总黄酮含量，α-葡萄糖苷酶抑制率，1，1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)清除率为指标，优化青钱柳总黄酮回流提取工艺，并进行放大验证；然后考察了青钱柳总黄酮在体外抑制α-葡萄糖苷酶，清除DPPH自由基的活性，最后在肥胖小鼠模型上评价了青钱柳总黄酮降低体质量及体脂含量，抗氧化、降血脂、降血糖等功效，为青钱柳总黄酮相关医药产品的深入研究提供参考。

1 仪器与材料

1.1仪器 UV-2500 紫外-可见分光光度计(日本岛津仪器公司)；ME203E 千分之一电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；Infinite M200 Pro多功能酶标仪[帝肯(上海)贸易有限公司]。

1.2药材与试剂 青钱柳叶购自遂昌县维尔康青钱柳中草药专业合作社，经广州医科大学附属第三医院伍月红副主任中药师鉴定为胡桃科青钱柳属青钱柳[Cyclocaryapaliurus(Batal.)Iljinskaja]的干燥叶；芦丁(纯度：92.5%，批号：100080-200707)标准品购自中国药品生物制品检定所；α-葡萄糖苷酶(批号：S0604A，罗氏分装)购自大连美仑生物技术有限公司；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG，批号：6MT2A-JA)购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，DPPH(批号：STBH2589)购自默克生命科学(上海)有限公司。

1.3实验动物 SPF级C57 BL/6J小鼠购于广东省医学实验动物中心，动物许可证号SCXK(粤)2013-0002，实验动物合格证号：44007200047800。实验动物饲养于恒温(20±2)℃、相对湿度 50%～70%、12 h明暗交替光照环境中，自由饮水、摄食。适应性喂养1周后用于实验。

2 方法与结果

2.1总黄酮含量测定方法学考察 采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法。精密称取芦丁标准品10.7 mg，用体积分数80%乙醇溶液定容至100 mL，得质量浓度107 μg·mL-1的标准品溶液。精密吸取标准溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL分别置于10 mL量瓶中，各加80% 乙醇溶液至5 mL，加5% NaNO2溶液0.5 mL，摇匀放置6 min，再加10% Al(NO3)3溶液0.5 mL，摇匀，再放置6 min，加4% NaOH 溶液4 mL，摇匀放置15 min，在波长510 nm处测定吸光度，计算黄酮质量浓度与吸光度的标准曲线，Y=0.004 2X-0.038 5(R2=0.999 2)，线性范围为10.7～107 μg·mL-1。

取芦丁标准品进行稳定性、精密度、加样回收率实验。结果表明芦丁标准品溶液在室温条件下1 h内稳定，RSD为1.60%；精密度试验的RSD为1.18%，结果表明仪器精密度良好；高、中、低3个浓度的加样回收率分别为104.90%，98.22%，95.83%。

2.2α-葡萄糖苷酶抑制活性考察 在96孔板中加入α-葡萄糖苷酶的PBS溶液(pH6.8，1U·mL-1)20 μL，和青钱柳总黄酮溶液(10 mg·mL-1)50 μL，于37 ℃孵育15 min，然后加入20 μL P-NPG 溶液(5 mmol·L-1)，再孵育20 min，最后加入Na2CO3(0.1 mmol·L-1)80 μL终止反应，在波长405 nm处测定吸光度(Asample)。空白对照组为α-葡萄糖苷酶20 μL 加入PBS(Acontrol)50 μL。按公式α-葡萄糖苷酶抑制率=[(Acontrol-Asample)/Acontrol]×100%，计算样品对α-葡萄糖苷酶的抑制活性[5]。

2.3DPPH 清除率考察 配制浓度为0.1 mol·L-1的DPPH无水乙醇溶液，取青钱柳总黄酮(10 mg·mL-1)样品溶液2 mL于试管中，再向试管中依次加入DPPH溶液2 mL，避光反应30 min后，在517 nm处测定吸光度(Asample)。以样品溶液加入2 mL无水乙醇溶液为样品对照组(Ablank)，以DPPH溶液中加入等量的无水乙醇溶液作为空白对照(Acontrol)，每组重复3次。按公式DPPH清除率=[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100%，计算DPPH清除率[6-8]。

2.4提取工艺单因素考察 精密称定青钱柳叶药材粉末50 g，以总黄酮含量为评价指标，考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数等因素对总黄酮提取率的影响。①乙醇浓度考察：固定料液比为1：10，回流时间为1.0 h，在乙醇浓度分别为55%，65%，75%，85%，95%的条件下提取1次；②料液比考察：固定乙醇浓度为80%，回流时间为1.0 h，在料液比分别为1：5，1：10，1：15，1：20，1：25的条件下提取1次；③提取时间考察：固定乙醇浓度为80%，料液比1：10，在提取时间分别为1.0，1.5，2.0 h的条件下各提取1次；④提取次数考察：固定乙醇浓度为80%，料液比为1：10，提取时间2.0 h，在提取次数分别为1，2，3次的条件下提取；分别测定各条件下提取物中总黄酮含量，缩小各因素的优化水平范围。

单因素考察结果显示，乙醇浓度是制约总黄酮提取率的关键因素，当乙醇浓度为75%～95%时，提取物中总黄酮的含量较高；总黄酮提取率随着料液比的增加而升高，当料液比超过1：15时，提取物中总黄酮的含量可达到峰值；经回流提取2次，每次2 h提取后，药材中总黄酮可基本提取完全。基于上述结果，本研究将通过Box-Behnken设计-响应面法进一步优化总黄酮的提取工艺。

2.5Box-Behnken设计-响应面法优化提取工艺

2.5.1实验设计与结果 以单因素实验的结果为基础，根据Box-Behnken 设计原理，选取乙醇体积分数(A，%)、料液比(B，g·mL-1)，提取次数(C，次)以及提取时间(D，h)为自变量，采用Design Expert 8.0.6版软件进行Box-Behnken实验设计。Box-Behnken 设计因素与水平见表1。

2.5.2层次分析法确定各指标权重 层次分析法(AHP)作为一种权重决策分析方法，已逐渐被引用至中药材及复方的提取工艺优化等领域[9-10]，本研究首先利用1-9标度法(表2)对所涉及指标进行两两比较评判，以确定各个指标的相对重要程度，然后按照几何平均法计算出各指标的权重系数[11-12]，见表3。本实验所得到α-葡萄糖苷酶抑制率、DPPH清除率、总黄酮含量、提取率的权重系数分别为0.518 9，0.327 0，0.107 7，0.046 4。对求得的各个权重系数进行一致性检验，得一致性指标(CI)=0.02≠0，接着计算随机一致性比率(CR)=0.02<0.1，说明指标层的判断矩阵和单排序结果的一致性可以接受，求得的权重系数合理有效，无逻辑混乱。根据AHP法计算的结果，分别给予α-葡萄糖苷酶抑制率(Y1)0.518 9、DPPH清除率(Y2)抑制率0.327 0、总黄酮含量(Y3)0.107 7、提取率(Y4)0.046 4的加权系数，求出综合评分(Y)。Y=[Y1(n)/Y1max×0.518 9+Y2(n)/Y2max×0.327 0+Y3(n)/Y3max×0.107 7+Y4(n)/Y4max×0.046 4]×100(n=1-29)，其中Y1max，Y2max，Y3max，Y4max分别为相应指标量的最大值。

表1 Box-Behnken设计因素与水平

Tab.1FactorsandlevelsofBox-Behnkendesign

水平乙醇浓度(A)/料液比(B)/(g·mL-1)提取次数(C)提取时间(D)/h-1751101108511521.519512032

2.5.3加权法综合评价青钱柳黄酮提取工艺 以单因素实验的结果为基础，根据Box-Behnken设计原理，选取乙醇浓度(A，%)，料液比(B，g·mL-1)，提取次数(C，次)，提取时间(D，h)为自变量，采用Design-Expert.8.0.6版软件设计实验。Box-Behnken 设计因素与水平见表4。

以加权综合评分值为响应值(Y)，采用Design-Expert.8.0.6软件对数据进行多元回归分析。得到回归方程Y=88.92+9.28A+4.45B+1.85C+3.25D+1.16AB+4.95AC+5.30AD+7.62BC-5.14BD-3.90CD-10.26A2-3.02B2-5.54C2-2.54D2，由方程可知，影响青钱柳总黄酮提取因素的主次顺序为A>B>D>C。各因素的方差分析结果见表5。由结果可知，本模型P<0.01，差异有统计学意义；模型的失拟项不显著(P=0.720 7>0.05)，表明误差导致模型拟合程度不佳的可能性较小，适用于对不同条件下所得总黄酮含量进行预测。此时，模型一次项A，B差异有统计学意义(P<0.05)，其中因素A差异有统计学意义；交互项中BC差异有统计学意义(P<0.05)，二次项A2，C2均差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。响应曲面坡度陡峭程度与对应条件的敏感度呈正相关，由图1各因素交互作用对响应值影响的响应曲面图可以看出，乙醇浓度表现极显著影响，液料比有显著影响，其次是提取次数和提取时间。

表2 目标数各层次评分标准

Tab.2Evaluationstandardoftargettreeatdifferentlevels

相对重要性定义1同等重要3稍重要5明显重要7强烈重要9绝对重要2,4,6,8以上相邻标度重要性的中间值倒数若i与j的重要性之比为aij,则j与i 的重要性之比为1/aij

2.6青钱柳总黄酮最佳提取工艺验证实验 经DesignExpert 8.0.6版软件分析，得到青钱柳总黄酮含量提取的最佳工艺条件：乙醇浓度为87.66%，料液比为1：10 g·mL-1，提取时间为1.99 h，提取次数1.64次，加权综合评分预测值96.65。但考虑到实验的实际操作性，将优化条件修改为：乙醇浓度为88%，料液比为1：10 g·mL-1，提取时间为2.0 h，提取次数2次。在此条件下进行3 次平行实验，所得提取物中总黄酮的含量分别为53.23，54.05，53.27 mg·(100 mg)-1，平均含量为53.52 mg·(100 mg)-1(RSD为0.86%)；总黄酮的提取率分别为21.50%，21.17%，20.79%，平均提取率为21.33%(RSD为1.67%)；α-葡萄糖苷酶的抑制率分别为84.56%，82.43%，82.19%，平均抑制率为83.06%(RSD为1.57%)；DPPH清除率分别为83.65%，83.82%，86.23%，平均抑制率为84.23%(RSD为2.17%)；计算得加权综合评分值为98.87，与预测值相对误差为4.28%。表明优选的工艺条件稳定可行。

表3 指标成对比较的判断优先矩阵

表4 Box-Behnken 设计方案及结果

2.7青钱柳黄酮总体外活性研究 依照“2.2”“2.3”所述α-葡萄糖苷酶抑制率和DPPH清除率评价方法，取按最优工艺得到的青钱柳总黄酮，设置浓度分别为0.5，1.58，5，15.8，50，158，500，1580，5000 μg·mL-1，评价α-葡萄糖苷酶抑制率和DPPH清除率，计算相应的半数抑制浓度(IC50值)。结果见图2。抑制α-葡萄糖苷酶的IC50值为(101.22±4.94) μg·mL-1，清除DPPH 自由基的IC50值为(23.75±1.93) μg·mL-1。

2.8青钱柳总黄酮对肥胖小鼠的影响 6～8周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠60只，适应性饲养1周，随机分为6组，空白对照组小鼠(CTR)给予普通饲料，模型对照组小鼠给予高脂高胆固醇饲料诱导肥胖[13-14]，模型小鼠分为模型对照组(Model)，二甲双胍组(MET，150 mg·kg-1)，青钱柳总黄酮大剂量组(CPFH，500 mg·kg-1)，青钱柳总黄酮中剂量组(CPFM，250 mg·kg-1)，青钱柳总黄酮小剂量组(CPFL，100 mg·kg-1)，灌胃给药，每天1次，连续12周，空白对照组和模型对照组给予等量0.9%氯化钠溶液，每周称量动物体质量。小鼠末次给药后禁食16 h，尾尖取血测定空腹血糖(FBG)，然后经戊巴比妥钠麻醉后腹腔取血，4000 r·min-1离心15 min制备血清；立刻分离肝脏、脑、肾周脂肪、附睾脂肪，称体质量。测定血清中胰岛素(FINS)、AST、ALT、TC、TG水平；冰浴制备10%肝组织PBS匀浆液，测定SOD、MDA含量，采用BCA法测定蛋白含量以校正SOD、MDA水平；计算脏器指数、体脂含量、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR，HOMA-IR =FBG×FINS/22.5)。

表5 方差分析结果

体质量及脏器指数分析结果可知，青钱柳总黄酮具有抑制高脂高胆固醇饲料诱导的C57小鼠体质量上升的作用，同时降低肝脏/体质量比率，升高脑/体重比率，使脏器指标趋向于正常饲喂组，提示青钱柳总黄酮对肥胖模型小鼠的肝、脑等器官具有保护作用。此外，青钱柳总黄酮能够降低脂肪在腹部肾脏周围以及附睾处堆积，具有抑制脂肪形成而控制体质量的作用，并呈现有量效关系。结果见图3。

生化指标分析结果可见，肥胖模型小鼠的血清转氨酶AST、ALT，血脂指标TG、TC，脂质过氧化指标MDA的水平都显著升高，氧化应激指标SOD水平则显著下降，空腹血糖和胰岛素抵抗指数显著升高。给予青钱柳总黄酮干预后，能降低转氨酶、炎症因子，以及血脂、血糖水平，改善脂质过氧化，并呈现有量效关系。结果见图4。

3 讨论

AHP 是一种将定性与定量相结合的系统分析方法，将其与多指标综合评分法结合应用于提取工艺的优选，能够更加全面、科学、客观地反映指标层对实验结果的影响。AHP 在进行赋权时，通过数理运算将各指标的重要性转变为可量化的权重系数，本研究在运用AHP确定权重时，综合考虑各药理活性及有效成分对各指标进行重要性评判[15]。

图1 各因素间的三维响应面图

图2 青钱柳总黄酮的体外活性(n=3)

Fig.2ActivityoftotalflavonoidsfromCyclocaryapaliurusinvitro(n=3)

本研究首次将Box-Behnken 设计-响应面法，结合层次分析应用于青钱柳总黄酮提取工艺的优化，通过研究因数与因数，因数与响应值之间的交互作用，利用多元二次回归对回归方程进行分析，更好地处理离散水平值，结合AHP方法的数理运算，将各指标的重要性转变为可量化的权重系数，进而精确地优化提取工艺。

①与模型对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.01；③与空白对照组比较，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01；③compared with blank control group，P<0.01.

①与模型对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.01；③与空白对照组比较，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01；③compared with blank control group，P<0.01.

体外活性研究表明，青钱柳总黄酮具有抑制α-葡萄糖苷酶的活性，能够延缓碳水化合物的消化吸收，从而起到降血糖的作用，同时具有清除DPPH自由基的活性，对于氧化应激导致的器官损伤具有保护作用。肥胖模型小鼠的药效实验结果与之相吻合。

动物实验结果表明，经青钱柳总黄酮干预后，能够降低脂肪在肥胖小鼠附睾及肾周的堆积，从而发挥抑制肥胖发展的作用；能够降低肝脏的脏器指标以及转氨酶水平，发挥保护肝脏的作用；能够改善血脂、血糖水平以及胰岛素抵抗指数，发挥调节胰岛素抵抗的作用。其次，青钱柳黄酮还能改善脂质过氧化，可能具有改善肥胖等因素诱导的脑退行性病变的功能[16]。本研究为青钱柳相关医药健康产品的开发提供了必要的研究基础，也为治疗肥胖等糖脂代谢综合征提供更多的选择药物。