蝙蝠葛诺林碱对原代培养大鼠皮层神经元氧糖剥夺损伤的保护作用*

倪岚，徐旭林，吕青，郭莲军

(华中科技大学同济医学院基础医学院药理学系， 武汉 430030)

蝙蝠葛(Menispermum dauricum，DC)，又名北豆根，为防己科药用植物蝙蝠葛的藤茎，广泛分布在我国东北、华北、华东等地。DC在我国很早就被用于治疗心脑血管疾病。现代药理学研究显示，从DC根茎提取的有效成分如蝙蝠葛酚性碱、蝙蝠葛苏林碱等具有抑制L型钙通道、抗血小板聚集[1]、降压、抗心律失常和抗脑缺血等作用[2]。蝙蝠葛诺林碱(Daurinoline)是一种从蝙蝠葛根茎中分离提取的单体物质，前期研究发现，蝙蝠葛诺林碱对家兔颈内动脉及基底动脉平滑肌具有明显的舒张作用[3-4]，对小鼠软脑膜微循环障碍亦有良好的改善[5]。然而，蝙蝠葛诺林碱对神经细胞缺血再灌损伤是否具有保护作用，笔者尚未见文献报道。因此笔者设计本实验，采用原代培养大鼠皮层神经元，通过氧糖剥夺(oxygen and glucose deprivation，OGD)再灌注的方法来模拟脑缺血再灌损伤，观察缺血再灌后蝙蝠葛诺林碱对大鼠皮层神经元的保护作用。并进一步观察细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)、线粒体膜电位(mitoehondrial membrane potential，MMP)的改变来探讨其作用机制，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 1～3 d龄的Sprague & Dawley(SD)乳鼠，清洁级，合格证号：00020736，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)20150007。动物房自然采光，室温(25±1) ℃，相对湿度(50±10)%。

1.2实验药物 蝙蝠葛诺林碱(淡黄色粉末，纯度>95%，同济医学院药理学系提供)临用前用稀盐酸配成0.1，1，10 μg·mL-1的浓度，过滤除菌，于4 ℃避光保存，备用；连二亚硫酸钠(批号：07032)购自南京化学试剂一厂；细胞培养所需试剂胎牛血清(批号：1587602)购自Gibco公司，-20 ℃保存；NeurobasalTMMedium(批号：1551304)、B27(批号：1769984)均购自Gibco公司；胰酶(trypsin，批号：J150009)购自HyClone公司，L-多聚赖氨酸(P1399)，阿糖胞苷(批号：w10562)均购自Sigma公司；其余试剂均为国产市售分析纯。MTT检测试剂盒(批号：C0009)、ROS检测试剂盒(批号：S0033)和线粒体膜电位试剂盒(批号：C2006)均购自碧云天有限公司(江苏，中国)。流式用磷酸盐缓冲液(10XPBS，g·L-1：NaCl 80.0，KCl 2.0，Na2HPO4·12H2O 36.3，KH2PO42.4，pH值7.2-7.4)，用前稀释至1倍使用。

1.3实验仪器 311型二氧化碳(CO2)培养箱(美国Thermo公司)；SW-CJ-2FD型超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；IX-71型倒置相差显微照相系统(OLYMPUS公司)；ELX8全自动酶标仪(德国Biotek仪器公司)。

1.4方法

1.4.1大鼠皮层神经元原代培养 取1～3 d龄的SD乳鼠，75%乙醇消毒后，断头并迅速剥离出全脑，取脑后仔细分离出大脑皮层，用D-Hanks液清洗后剪成组织块约1 mm3，加入等体积0.25%胰蛋白酶37 ℃消化15 min。DMEM/F12培养液(含10%胎牛血清，100 μg·mL-1青霉素，100 μg·mL-1链霉素)终止消化后将组织块吹打成细胞悬液，200目不锈钢筛选网过滤，2000×g离心10 min，弃上清液，在细胞沉淀中加入DMEM/F12培养液，重悬细胞，通过显微镜观察，计数板计数，调整细胞密度至5×105·mL-1，接种在预先用0.1%多聚赖氨酸处理的培养板或培养皿内，置CO2培养箱内培养。24 h后换液成Neurobasal培养液(含10% B27，100 μg·mL-1青霉素，100 μg·mL-1链霉素)，第3天加入阿糖胞苷(20 μmol·L-1)作用24 h抑制神经胶质细胞生长。以后隔天换液，直到相关实验结束[6]。

1.4.2OGD模型制备与实验分组 取培养8 d的皮层神经元，利用拆信封法随机分为正常对照组；模型对照组；蝙蝠葛诺林碱(0.1，1，10 μg·mL-1)预处理组，每组 6孔(n=6)，重复3次。蝙蝠葛诺林碱在OGD前24 h给予。上述各组孵育24 h后，正常组加入200 μL含糖的Earle’s液，模型对照组和给药组加入2 mmol· L-1连二亚硫酸钠的无糖Earle’s液，于CO2培养箱内(37 ℃，5% CO2，95% O2)孵育4 h后进行细胞活性检测[7-8]。

1.4.3噻唑蓝(MTT)测定细胞存活率 OGD结束后，向接种细胞的96孔板中加入MTT(5 g·L-1，每孔200 μL)，培养箱(37 ℃，5%CO2，95%O2)孵育4 h。孵育结束后将上清液去除，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，气浴震荡仪震荡10 min使深蓝色甲臜充分溶解，用全自动酶标仪测定各孔在570 nm处的吸光度(A)值。细胞存活率=(测定组A570-测定空白A570)/(正常组A570-测定空白A570)×100%。

1.4.4细胞内ROS测定 应用二氯二氢荧光素二乙酯(2，7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)荧光探针进行细胞内ROS的检测。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜进入细胞，被细胞内的脂酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，进而使探针负载于细胞内。细胞内ROS氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。DCF的荧光可用于反应细胞内的活性氧水平。细胞按“1.4.1”项操作处理后，加入稀释好的10 μmol·L-1DCFH-DA，37 ℃孵育30 min后，用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。DCF的荧光强度利用流式细胞仪检测。实验结果以正常组为100% 进行换算[9]。

1.4.5细胞内MMP的测定[10]培养细胞加入适当体积的JC-1工作液，37 ℃孵育20 min，用无血清细胞培养液洗涤3次，以充分去除细胞外的JC-1，然后加入JC-1缓冲液0.3 mL，用流式细胞仪检测。JC-1单体激发光490 nm，发射光530 nm；JC-1聚合物激发光525 nm，发射光590 nm。实验结果以正常组为100%进行换算。

2 结果

2.1蝙蝠葛诺林碱对培养皮层细胞活性的影响 细胞形态学变化：正常组神经元胞体饱满，边缘光滑，有较强折光性；损伤组神经元细胞核固缩，胞体膨胀甚至破裂，细胞膜不完整，折光性差，给药后这种情况明显改善，见图1。

2.2蝙蝠葛诺林碱对培养皮层元细胞存活率MTT实验的影响 正常对照组的神经元百分存活率为(100±29.12)%，模型对照组神经元百分存活率为(54.11±6.62)%，与正常对照组比较，模型对照组神经元的百分存活率明显降低(P<0.05)；蝙蝠葛诺林碱小剂量处理组神经元的百分存活率为(67.53±10.54)%，与模型对照组比较存活率明显升高(P<0.05)；中剂量处理组的细胞存活率为(71.50±9.79)%，与模型对照组比较存活率明显升高(P<0.05)；大剂量处理组的细胞存活率为(87.48±5.29)%，与模型对照组比较存活率明显升高(P<0.05)，见图2。

2.3蝙蝠葛诺林碱对OGD-R引起细胞内ROS增加的影响 流式细胞实验的结果表明，经OGD-R处理的细胞，胞内DCF荧光强度显著增高，而蝙蝠葛诺林碱处理后，胞内DCF荧光强度明显降低。统计结果显示，与OGD模型对照组比较，1和10 μg·mL-1的蝙蝠葛诺林碱降低细胞内ROS比例高达230.09%和354.05%(P<0.05)，而低浓度(0.1 μg·mL-1)蝙蝠葛诺林碱对OGD诱导产生的ROS无显著性影响，见图3。

2.4蝙蝠葛诺林碱对OGD-R引起MMP下降的影响 蝙蝠葛诺林碱显著降低OGD-R所致的线粒体膜去极化程度，表现为红色荧光增强，绿色荧光减弱。与模型对照组比较，蝙蝠葛诺林碱(1，10 μg·mL-1)分别降低MMP为24.66%和37.88%(P<0.05)，而低浓度(0.1 μg·mL-1)作用不明显，见图4。

3 讨论

脑缺血再灌注损伤与ROS的过量产生密切相关，其发生过程包括：DNA的氧化损伤后易导致基因突变或细胞死亡；蛋白质中与功能有关的氨基酸成分对自由基或脂质过氧化的中间产物特别敏感，使酶活性、生物膜和细胞的功能、代谢发生异常变化，膜脂质过氧化，导致细胞膜在内的所有膜性结构细胞器受损，而引起相应功能障碍[11]。本研究通过利用DCFH-DA荧光探针检测大鼠原代培养皮层神经元缺血缺氧损伤后ROS含量的变化，实验结果显示，OGD模型中神经元细胞ROS含量明显增加，而蝙蝠葛诺林碱剂量依赖性减低细胞内ROS水平，提示蝙蝠葛诺林碱对神经细胞缺血再灌注损伤的保护作用，可能与减少细胞内活性氧的产生有关。

A.正常对照组；B.OGD组；C.蝙蝠葛诺林碱(0.1 μg·mL-1)组；D.蝙蝠葛诺林碱(1 μg·mL-1)组；E.蝙蝠葛诺林碱(10 μg·mL-1)组。

图1 5组神经元形态学变化(×250)

A.normal control group；B.OGD group；C.daurinoline(0.1 μg·mL-1)group；D.daurinoline(1 μg·mL-1)group；E.daurinoline(10 μg·mL-1)group.

Fig.1Morphologicalchangesofneuronsinfivegroups(×250)

①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.05.

线粒体是神经元凋亡信号的中心中转站和能量转换场所，产生三磷酸腺苷为细胞提供能量。另一方面线粒体产生的活性氧簇介导分子信号，触发急性凋亡激活物的释放，也是细胞死亡通路的整合元件。在脑缺血再灌注损伤中，很多因素如胞质及线粒体基质Ca2+超载、氧化应激过度、能量耗竭、诱导凋亡的Bcl-2家族蛋白等均可促进线粒体的通透性转换孔(mitochondrial permeability transitionpore，MPTP)不可逆过度开放[12]，导致线粒体跨膜电位崩解，呼吸链解耦联，线粒体基质渗透压升高，线粒体肿胀，外膜破裂，最终导致依赖Cyt-c和caspase途径的细胞凋亡[13]。本实验发现大鼠原代培养皮层细胞OGD损伤后，细胞内ROS的产生增多，线粒体跨膜电位降低。蝙蝠葛诺林碱可剂量依赖性稳定线粒体膜电位。

综上所述，在原代培养的大鼠皮层细胞OGD-R模型中，蝙蝠葛诺林碱通过抑制细胞内ROS产生，稳定线粒体膜电位，保护线粒体的功能，从而发挥对缺血再灌注损伤的神经保护作用。

①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。

①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。