夏枯草胶囊对自身免疫性甲状腺炎大鼠NF-κB通路及免疫指标的影响

李 嫚，涂瑞沙，余书勇，徐小江，尹俊峰

自身免疫性甲状腺炎是指以机体自身甲状腺组织作为抗原的自身免疫性疾病，又称为桥本甲状腺炎[1]。自身免疫性甲状腺炎的发病机制与诱发因素较复杂，可能与遗传、免疫及环境等多种因素有关，而甲状腺抗体对机体而言视为破坏性抗体，会引起机体免疫调节发生改变[2]。目前该疾病无特定的治疗措施，大部分患者是在甲状腺功能减退的情况下才开始用药治疗[3]。夏枯草是唇形科、夏枯草属的多年生草本植物，其干燥果穗可入药，辛、苦、寒，具有清热泻火、明目、散结消肿的功效。夏枯草在抗菌、抗病毒、抗过敏、降血压及血糖等方面均有显著效果，临床可将其用于高血压、肺结核以及甲状腺肿大等疾病治疗[4]，还可以减轻大鼠记忆力损伤[5]。夏枯草胶囊的主要成分是夏枯草提取物，可以改善桥本甲状腺炎患者的甲状腺功能[6]，但关于其对自身免疫性甲状腺炎的作用机制以及对机体自身免疫情况的研究报道较少。因此，本研究通过制备自身免疫性甲状腺炎大鼠模型来探索夏枯草胶囊对其免疫指标及NF-κB信号通路的影响，为自身免疫性甲状腺炎临床治疗方案制定提供参考依据。

1 材料和方法

1.1试剂及仪器 夏枯草胶囊(国药准字Z19991033，聚协昌北京药业有限公司，规格：0.35×10粒×2板)，全弗式佐剂(CFA)与不全弗式佐剂(IAF)购自美国Sigma公司，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(中国上海乔羽生物科技有限公司)，白介素-12(IL-12)试剂盒(中国北京冬歌博业生物科技有限公司)，IL-10试剂盒(中国上海广锐生物科技有限公司)，干扰素-γ(INF-γ)试剂盒(中国上海机纯实业有限公司)，甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)试剂盒(中国上海冠导生物工程有限公司)，甲状腺球蛋白抗体(TGAb)试剂盒(中国上海茁彩生物科技有限公司)，NF-κB抗体(佰思诺天津生物科技有限公司)，显微镜(Ti2-U，NIKON)，切片机(HM 340E，赛默飞)。

1.2动物及分组 SPF级SD雄性健康大鼠50只，4～5周龄，体质量190～210 g，购于南方医科大学，生产许可证号SCXK(粤)2016-0041，适应性饲养1周，培育室温度为20～25℃，湿度40%～50%，人工光照昼夜时间各12 h，饮水自由。将50只SD大鼠随机分别为对照组、模型组、干预组，干预组又分为夏枯草低剂量组、夏枯草中剂量组、夏枯草高剂量组。每组10只。

1.3实验方法

1.3.1模型制备：制模过程参考文献[7]，将甲状腺球蛋白(PTg)与CFA等体积混合乳化液于大鼠足垫部皮下与背部皮下多位点注射，其中PTg注射剂量为每只100 μg，1次/周，连续2周，完成初次免疫；从第3周开始至第6周，将PTg与IAF等体积混合乳化液进行注射，PTg剂量及皮下注射方式与上相同。

1.3.2药物干预：各组大鼠第7周开始进行药物干预，根据夏枯草胶囊成年人服用的最大剂量、大鼠与成人药物折算系数(W)6.25进行换算，得出大鼠夏枯草胶囊的最大使用剂量为112 mg/100 g，夏枯草低、中、高剂量组大鼠分别进行28、56、112 mg/(100 g·d)灌胃干预，模型组及对照组大鼠灌胃等体积的生理盐水，连续干预4周。

1.4检测指标 药物干预结束后，采取组织及血液，观察各组大鼠甲状腺病理组织变化，检测甲状腺激素水平[血清三碘甲状腺素(T3)、甲状腺素(T4)、促甲状腺素(TSH)]、自身免疫抗体(TGAb、TPOAb)水平、炎性因子(IL-10、IL-12、TNF-α、INF-γ)水平以及甲状腺组织中NF-κB蛋白水平，检测各组大鼠甲状腺组织中Bax、Bcl-2基因相对表达量。

1.4.1HE染色：末次给药后次日，麻醉处死大鼠，取出甲状腺组织，一部分甲状腺组织固定于10%甲醛中性溶液中，经常规石蜡切片，苏木精、伊红染色、脱水、透明、固定封片，于显微镜下观察各组大鼠甲状腺组织病理结构。

1.4.2蛋白免疫印迹(Western blot)：将采集的甲状腺组织一部分置于-80℃超低温冰箱存储，用于Western blot与RT-PCR实验，提取组织总蛋白，调整蛋白质浓度，经SDS-PAGE电泳、膜转移至PVDF膜，加入NF-κB、β-actin一抗，于4℃条件下孵育过夜，再用TBST漂洗40 min，分为3次漂洗，再加入经HRP标记的二抗继续孵育1 h，根据ECL试剂盒说明书对蛋白条带进行显影、定影，观察各组蛋白条带成像情况，并进行蛋白条带分析。

1.4.3RT-PCR：采用Trizol试剂盒提取甲状腺组织的总RNA，根据逆转录cDNA试剂盒说明书逆转录生成cDNA，参考RT-PCR试剂盒说明书进行PCR反应体系配比、扩增体系设置，所用内参基因及Bax、Bcl-2引物均由上海生工提供，以2-ΔΔCt计算目标基因的相对表达量。

1.4.4甲状腺激素、自身免疫抗体及炎性因子检测：末次给药后次日，麻醉各组大鼠，采取心脏血2 ml，3000 r/min离心20 min，取上层血清用于实验，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测TGAb、TPOAb、T3、T4、TSH、IL-10、IL-12、TNF-α、INF-γ水平，详细操作过程参考试剂盒说明书。

2 结果

2.1大鼠甲状腺组织病理情况比较 采用HE染色观察各组大鼠甲状腺组织病理情况，结果显示对照组甲状腺滤泡形状椭圆形，且大小均匀排列，滤泡中充满胶质，无炎性浸润；模型组大鼠甲状腺滤泡形状不规则，有劈裂情况，且滤泡间隙增大，滤泡中胶质较少，有明显炎性浸润；夏枯草组甲状腺滤泡形态较模型组规则，滤泡腔内含有胶质，炎性浸润减少。见图1。

2.2大鼠T3、T4、TSH比较 模型组与夏枯草低、中、高剂量组血清T3、T4、TSH水平均明显高于对照组(P<0.05)；夏枯草低、中、高剂量组血清T3、T4、TSH水平低于模型组，且随着剂量的增加而逐渐降低(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠血清T3、T4、TSH水平比较

注：夏枯草低、中、高剂量组分别给予夏枯草胶囊28、56、112 mg/(100 g·d)；T3为血清三碘甲状腺素，T4为甲状腺素，TSH为促甲状腺素；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与夏枯草低剂量组比较，eP<0.05；与夏枯草中剂量组比较，gP<0.05

2.3大鼠自身免疫抗体水平 模型组与夏枯草低、中、高剂量组TGAb、TPOAb水平均高于对照组(P<0.05)；夏枯草低、中、高剂量组TGAb、TPOAb水平均低于模型组，且随着剂量的增加而逐渐降低(P<0.05)。见表2。

2.4大鼠血清炎性因子水平 模型组与夏枯草低、中、高剂量组血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平高于对照组，而IL-10水平低于对照组(P<0.05)；夏枯草低、中、高剂量组血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平低于模型组，而IL-10水平高于模型组，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表3。

表2 5组大鼠TGAb、TPOAb水平比较

注：夏枯草低、中、高剂量组分别给予夏枯草胶囊28、56、112 mg/(100 g·d)；TGAb为甲状腺球蛋白抗体，TPOAb为甲状腺过氧化物酶抗体；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与夏枯草低剂量组比较，eP<0.05；与夏枯草中剂量组比较，gP<0.05

表3 5组大鼠血清炎性因子水平比较

注：夏枯草低、中、高剂量组分别给予夏枯草胶囊28、56、112 mg/(100 g·d)；IL-10为白介素-10，IL-12为白介素-12，TNF-α为肿瘤坏死因子-α，INF-γ为干扰素-γ；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与夏枯草低剂量组比较，eP<0.05；与夏枯草中剂量组比较，gP<0.05

2.5大鼠NF-κB、Bax、Bcl-2水平 模型组与夏枯草低、中、高剂量组NF-κB蛋白水平高于对照组，Bcl-2 mRNA水平低于对照组(P<0.05)；模型组Bax mRNA水平高于对照组，夏枯草低、中、高剂量组Bax mRNA水平均低于对照组(P<0.05)；夏枯草低、中、高剂量组NF-κB蛋白和Bax mRNA水平均低于模型组，而Bcl-2 mRNA水平高于模型组(P<0.05)。见图2、表4。

图2 5组大鼠甲状腺组织NF-κB蛋白水平蛋白免疫印迹结果

1.对照组；2.模型组；3.夏枯草低剂量组；4.夏枯草中剂量组；5.夏枯草高剂量组

表4 5组大鼠甲状腺组织NF-κB蛋白与Bax、Bcl-2基因水平比较

注：夏枯草低、中、高剂量组分别给予夏枯草胶囊28、56、112 mg/(100 g·d)；与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05；与夏枯草低剂量组比较，eP<0.05；与夏枯草中剂量组比较，gP<0.05

3 讨论

自身免疫性甲状腺炎属于免疫性疾病，临床常采用甲状腺激素替代治疗、免疫治疗等措施，病情严重者会采取手术治疗。西药在自身免疫性甲状腺炎治疗过程中取得较好疗效，尤其当患者出现其他急症时，西药治疗可以快速缓解患者的病情，但是单纯西医治疗也存在不良反应多的局限性。中医认为自身免疫性甲状腺炎属于“瘿病”及“虚劳”的范畴，其发病与饮食失调、七情内伤、先天失养等多种因素有关。夏枯草胶囊是夏枯草中药制剂，具有抗病毒、抗炎以及降血糖等多种功效，广泛应用于临床[8]。本研究结果显示，自身免疫性甲状腺炎大鼠的甲状腺滤泡呈现出形状不规则，间隙较大且其中胶质较少，还有炎性浸润，而夏枯草胶囊干预可以明显减轻这种病理变化，表明夏枯草胶囊对自身免疫性甲状腺炎大鼠的甲状腺组织结构损伤有较好的保护作用。

甲状腺能够调节机体能量代谢速度、机体合成蛋白以及调节机体对多种激素的敏感性，行使这些功能主要是通过甲状腺素来实现。本研究结果显示，模型组血清T3、T4水平升高，同时还发现血清TSH、TGAb、TPOAb含量也增加，提示自身免疫性甲状腺炎大鼠的甲状腺功能呈现出减退情况。夏枯草胶囊干预后可以降低大鼠血清T3、T4、TSH、TGAb、TPOAb含量，此结果与俞灵莺等[9]研究结果相似，由此表明夏枯草胶囊可以改善自身免疫性甲状腺炎大鼠的甲状腺功能。甲状腺组织病理结果以及机体血清学指标均表明自身免疫性甲状腺炎大鼠的甲状腺功能存在损伤，而夏枯草胶囊干预治疗可以缓解这种情况，也证实夏枯草胶囊确实可以用于治疗此类疾病。

淋巴细胞以及自身抗体介导的免疫反应也参与自身免疫性甲状腺炎的发生，如Th细胞介导产生的炎性因子。Th1细胞可以分泌TNF-α以及INF-γ等细胞因子，参与机体细胞免疫[10]。Th2细胞可以分泌IL-10、IL-6等因子，参与机体体液免疫[11]。IL-12主要是由B细胞、巨噬细胞产生，能够促进活性T细胞增殖，促进Th0细胞向Th1细胞分化，同时还可以诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)与NK细胞的毒性并促进其分泌TNF-α、INF-γ等细胞因子[12-13]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平增高，IL-10含量降低，而夏枯草胶囊干预后可以降低大鼠血清IL-12、TNF-α、INF-γ水平，提高IL-10含量。王永清等[14]认为夏枯草可通过有效降低毒性弥漫性甲状腺炎患者自身抗体水平来调节机体的异常免疫功能，减轻机体的炎性反应，改善患者甲状腺功能。由此推测夏枯草胶囊可能通过调节机体IL-12、TNF-α、INF-γ、IL-10水平来降低自身免疫性甲状腺炎大鼠机体炎性反应。TNF-α作为促炎因子之一，其与体内多种炎性信号通路活化有关，包括NF-κB信号通路。在免疫性疾病的研究中发现，TNF-α能够激活NF-κB信号通路，再反向启动TNF-α的转录，形成正反馈环[15]。本研究结果显示，模型组大鼠甲状腺组织中的NF-κB蛋白水平明显高于对照组，由此推测，NF-κB信号通路在自身免疫性甲状腺炎大鼠呈现出活化状态。

Cho等[16]研究发现，夏枯草水性提取物可以通过抑制NF-κB/Snail信号通路以及调节上皮间质转化相关蛋白水平抑制肿瘤细胞侵袭、转移，具有抑制恶性肿瘤转移的活性。本研究结果显示，夏枯草胶囊干预治疗可以降低自身免疫性甲状腺炎大鼠NF-κB蛋白水平，由此推测夏枯草胶囊可以抑制自身免疫性甲状腺炎大鼠NF-κB信号通路激活。激活NF-κB信号通路不仅可以促进TNF-α转录，还可以促进其下游凋亡、增殖等相关蛋白表达，参与机体的免疫应答反应、炎性反应以及细胞凋亡等多种生理或病理过程[17]。Bcl-2基因过量表达可以抑制细胞凋亡，Bax基因过量表达会促进细胞凋亡，二者在细胞凋亡进程起着拮抗作用[18-19]。本研究结果显示，夏枯草可以降低自身免疫性甲状腺炎大鼠Bax基因表达，促进Bcl-2基因表达。余欣然等[7]研究显示，夏枯草胶囊可以抑制甲状腺滤泡细胞的凋亡，从而减轻甲状腺功能损伤。祁岗等[20]研究显示，自身免疫性甲状腺炎小鼠甲状腺组织中Bcl-2呈现出高表达现象，本研究结果与报道不一致，分析原因为可能还存在其他作用途径来调控基因表达，还需要进一步研究。

综上所述，夏枯草胶囊对自身免疫性甲状腺炎大鼠的甲状腺功能有一定的改善作用，还能调节机体自身免疫抗体水平，可能是通过降低IL-12、TNF-α、INF-γ水平，增加IL-10含量来减轻机体的炎性反应，还有可能是通过抑制NF-κB信号通路活化，降低其介导的炎性反应；同时还可以影响凋亡相关基因表达，但其中作用机制还需要更深层次研究。