黄葵胶囊对阿霉素肾病大鼠肾组织MCP-1表达及对肾组织病理损伤的影响

赵塔娜，蔡栋梁，苑露丹

(佳木斯大学附属第一医院 1.儿二科；2.老年病科,黑龙江 佳木斯154001)

肾脏疾病的进展过程由多种细胞炎性因子参与其中，最终进展为终末期肾病(ESDR)。MCP-1在单核细胞趋化以及促肾脏纤维化过程中扮演着十分重要的角色[1]。近年来，黄葵及其提取物制剂被广泛地应用于各种类型的肾脏疾病之中，其临床疗效较为理想[2]。本研究主要采用基础实验的方法，探讨了黄葵胶囊对AN大鼠肾组织MCP-1的表达情况及其对肾组织病理损伤产生的影响，现报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物选择佳木斯大学动物培养中心提供的30只清洁级雄性SD大鼠作为实验动物，体重范围为108 g-134 g，平均(119.78±10.98) g。使用标准饲料进行饲养，自由摄食、进水。

1.2 药物及试剂阿霉素(ADR)：海正辉瑞制药有限公司生产，批准文号：国药准字H33021980号；黄葵胶囊：江苏苏中药业集团股份有限公司生产，批准文号：国药准字Z19990040号；MCP-1抗体、二抗均购自于上海钰博生物科技有限公司；免疫组化染色试剂盒购自于上海联迈生物工程有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1动物建模 首先取健康SD雄性大鼠于尾静脉一次性注入6.5 mg/kg的盐酸阿霉素，于第7 d及第14 d置于代谢笼中，留24 h尿液，并注意对小鼠尿蛋白进行测定分析。如果24 h尿蛋白定量在100 mg以上，则表明动物造模已成功。

1.3.2动物分组及药物干预 正常组大鼠10只，剩余的20只为建模大鼠。根据随机数字表法，随机分为模型对照组(n=10)及治疗组(n=10)。黄葵治疗方法为：每次给药1粒，溶化成药液，3次/d，给药剂量为2.0 g/(kg·d)，给药方式为灌胃，1个疗程为8周，正常组与模型对照组均给予与黄葵等量的生理盐水灌胃，同样为8周。根据体表面积公式：A=K×W2/3，对大鼠每天所需要的药物剂量进行计算。

1.4 检测项目及方法

1.4.124 h尿蛋白 在灌注药物及生理盐水后第2周及第8周时，放置代谢笼，并留取24 h尿液，使用考马斯亮蓝法对24 h尿蛋白定量指标水平进行检测分析。

1.4.2血生化指标 实验第2周及第8周时，每组均分别采取断椎法处死大鼠，于股动脉取血，经离心后取上清液，使用贝克曼库尔特AU5800型全自动生化分析仪对血肌酐(Scr)及血白蛋白(Alb)水平进行检测分析。

1.4.3肾组织形态 将处死过的大鼠肾脏皮质溶于浓度为10%的福尔马林溶液中进行固定，使用石蜡包埋之后，再行HE染色，然后于光镜下对肾组织病理改变情况进行观察。

1.4.4SP法检测肾组织MCP-1蛋白的表达情况 按试剂盒说明书操作。在图像采集分析系统下，于每张切片上随机采集5个不重叠的视野，棕黄色部分则表示为MCP-1阳性表达。采用Image图像分析软件对图像进行分析，对每个视野中的肾间质阳性染色总面积进行测量，取均值。MCP-1在肾组织阳性表达指数=阳性信号面积/视野面积。

2 结果

2.1 一般状况各组大鼠在建模之前反应比较灵敏，毛发光滑度佳。大鼠建模3 d之后，大鼠发生精神萎靡、活动减少等方面的情况，部分大鼠发生体毛稀疏、反应迟钝等情况，上述症状在模型对照组中表现更为显著，黄葵治疗组整体情况要比模型对照组好。

2.2 各组24 h尿蛋白定量变化情况对比第2周、第8周模型对照组与治疗组24 h尿蛋白定量水平均高于相应时点的正常大鼠24 h尿蛋白定量水平(P均<0.05)，且治疗组第2周、第8周时24 h尿蛋白定量水平均分别显著小于模型对照组对应时点的24 h尿蛋白定量水平(P均<0.05)，见表1。

表1 各组24 h尿蛋白定量变化情况比较

注：与正常对照组比较，①P<0.05；与模型对照组比较，②P<0.05.

2.3 各组大鼠血生化指标水平对比第2周、第8周模型对照组与治疗组血Scr水平均高于相应时点的正常对照组大鼠血Scr水平(P均<0.05)，且治疗组第2周、第8周时血Scr水平均分别显著小于模型对照组对应时点的血Scr水平(P均<0.05)；第2周、第8周模型对照组与治疗组血Alb水平均低于相应时点的正常对照组大鼠血Alb水平(P均<0.05)，且治疗组第2周、第8周时血Alb水平均分别显著高于模型对照组对应时点的血Alb水平(P均<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠生化指标水平比较

注：与正常对照组比较，①P<0.05；与模型对照组比较，②P<0.05.

2.4 各组大鼠不同时点肾组织光镜检查结果对比光镜HE染色结果：经光镜检查，正常对照组大鼠肾小球、肾间质、肾小管等均正常。第2周末时，模型对照组少数大鼠肾小球存在基质与系膜细胞轻度增生，有少量肾小球包氏囊厚度增大，球囊发生粘连现象，少量肾小管出现扩张，剩下大鼠的肾组织无显著异常现象(见下图1所示)；第8周末时，模型组大鼠肾小球存在局灶节段硬化的现象，出现包氏囊厚度增加以及球囊出现粘连，某些肾小管出现萎缩，部分肾间质出现纤维化现象，且在光镜下可探查局灶性炎症细胞发生浸润反应。在同一时间节点，治疗组大鼠肾脏病变较模型组大鼠要更加轻微(见下图2所示)。

图1 实验2周末时各组肾组织切片光镜HE染色(×40)

图2 实验8周末时各组肾组织切片光镜HE染色(×40)

2.5 各组大鼠不同时点肾组织MCP-1阳性表达情况对比第2周、第8周模型对照组与治疗组MCP-1在肾组织阳性表达指数均高于相应时点的正常对照组大鼠MCP-1在肾组织阳性表达指数(P均<0.05)，且治疗组第2周、第8周时MCP-1在肾组织阳性表达指数均分别显著小于模型对照组对应时点的MCP-1在肾组织阳性表达指数(P均<0.05)，见表3。

表3 各组大鼠不同时点肾组织MCP-1阳性表达情况比较

注：与正常对照组比较，①P<0.05；与模型对照组比较，②P<0.05.

3 讨论

阿霉素肾病模型与人类微小病变型肾病相类似，该模型主要采取雄性大鼠或者SD大鼠尾静脉单次注射5-7.5 mg/kg的阿霉素，在ADR注射入大鼠体内4-5 d之后出现尿蛋白现象，14 d后尿蛋白水平会出现峰值，然后发生典型性的肾病表现，伴随浮肿、高脂血症、低蛋白血症等并发症，上述症状持续时间一般在半年以上。本研究所采用的大鼠，平均体重(119.78±10.98)g，尾静脉注射ADR剂量为6.5 mg/kg。与正常对照组相比，模型对照组大鼠表现精神状况较萎靡，出现短时间腹泻症状，纳差，体重显著下降。模型对照组大鼠在尾静脉注射ADR后一周，尿蛋白水平显著升高，到第2周时，模型组(模型对照组、治疗组)大鼠24 h尿蛋白定量均远远超过100 mg，且模型组24 h尿蛋白定量显著高于正常对照组(P均<0.05)，此结果提示：本研究大鼠造模非常成功。

MCP-1的表达主要受核转录因子-β(NF-β)与转录活化蛋白1(TAP-1)之间的协调作用所决定的。曹阳等[3]通过综述的方法，阐述了MCP-1与肾病综合征之间的关系。所以，将肾组织中的MCP-1的过度表达进行抑制，能够有效降低单核细胞、中性粒细胞同血管内皮细胞之间的黏附作用，对单核细胞趋化以及激活单核细胞释放出的各种细胞因子进行抑制，从而使得肾脏损伤程度得以显著减小，蛋白尿水平显著下降[4]。

现代药理研究证实：黄葵中包括槲皮素、杨梅黄素等在内的5种黄酮类化合物单体，具有抗肾小球免疫炎性反应、降低尿蛋白水平以及抗血小板聚集、保护肾脏功能等方面的效果[5-10]。本研究结果提示：黄葵胶囊能够有效降低ADR肾病大鼠24 h尿蛋白量、血Scr水平及MCP-1阳性表达指数，提高血Alb水平。此外，本研究结果还显示：黄葵还能够有效保护ADR肾病大鼠的肾脏组织。陈洪宇等[11]探讨了中药防己黄芪汤加减治疗阿霉素肾病大鼠的疗效及其对大鼠肾组织MCP-1的影响，经肾组织切片光镜HE染色，结果显示：治疗组治疗8周后肾组织未见明显异常状况，且治疗组治疗8周后肾组织MCP-1表达的阳性指数均较模型对照组显著下降(P均<0.05)，本研究结果与其相类似。

综上所述，黄葵胶囊能够降低ADR肾病大鼠24 h尿蛋白量、血Scr及MCP-1阳性表达指数及提高血Alb水平，改善大鼠肾组织功能。