丹参素对缺氧/复氧诱导H9C2心肌细胞损伤和内质网应激的改善作用

丁玉红，郭秀颖

(吉林大学第一医院二部 皮肤科，吉林 长春130031)

冠心病治疗过程中，在缺血的基础上恢复血液灌注后，心肌组织的损伤不仅没有缓解反而变得更加严重，甚至出现不可逆性损伤，即心肌缺血再灌注损伤(I/R)[1]。有研究表明I/R可诱发内质网应激(ERS)，而ERS又在I/R的病理进程中发挥关键作用，持久剧烈的ERS则会诱发细胞凋亡[2,3]。丹参作为一种传统的活血化瘀中药，常用于冠心病的治疗[4,5]。丹参素(DLA)作为丹参中主要的活性成分，具有广泛的临床应用前景[6,7]。但丹参素能否通过调节内质网应激改善心肌I/R损伤目前尚未报道。本研究拟在离体培养的H9C2人心肌细胞上，观察丹参素对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞损伤的改善作用，从抗内质网应激和抗凋亡等方面探讨丹参素对H/R 损伤的保护机制，旨在为其临床应用提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器丹参素购自中国云南昆明风山渐医药研究有限公司。H9C2人心肌细胞购自美国ATCC细胞库。高糖DMEM 培养基、无糖DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco 公司；胰酶、青霉素/链霉素双抗及DMSO 购自美国Sigma 公司；LDH、CK-MB、MDA和SOD活性的ELISA试剂盒购自Andygene公司。抗体GRP78和Caspase-12购自Abcam公司；抗体 Bax、Bcl-2、cleaved caspase3、SOD、GAPDH和抗兔的二抗购自CST公司。BCA 蛋白定量试剂盒购自北京普利莱公司。余为市售分析纯产品。二氧化碳细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司； 超净工作台购自上海智成分析仪器制造有限公司；高速低温离心机(湖南湘仪公司)；DYY电泳仪(北京六一仪器厂)；DYCZ-转膜仪(北京六一仪器厂)；X线胶片(乐凯公司)；电子分析天平(德国赛多利斯公司)；脱色摇床(北京六一仪器厂)；PVDF转移膜(GE Healthcare公司，0.42 μm)；超纯水仪购自美国Merck Millipore公司。

1.2 H9C2人心肌细胞H/R 模型构建和分组

H9C2人心肌细胞(含10%血清的高糖DMEM培养基)培养到对数生长期。缺氧处理前将高糖DMEM培养基换为无糖DMEM培养基，放入厌氧箱37℃恒温培养。缺氧结束后，新鲜的高糖DMEM培养基替换无糖DMEM培养基，放入正常细胞培养箱中培养。实验分为正常对照组，H/R组和丹参素给药组。正常对照组:用高糖DMEM培养基培养H9C2心肌细胞30 h。H/R组:缺氧处理前将高糖DMEM培养基换为无糖DMEM培养基，放入厌氧箱37 ℃恒温培养6 h。缺氧结束后，高糖DMEM培养基替换无糖DMEM培养基，放入正常细胞培养箱中培养24 h。DLA给药组:缺氧处理前将高糖DMEM培养基换为无糖DMEM培养基，加入DLA(10-6M)缺氧培养6 h。缺氧结束后，高糖DMEM 培养基替换无糖DMEM培养基，放入正常细胞培养箱中培养24 h。

1.3 ELISA法检测H9C2人心肌细胞中LDH、CK-MB、MDA含量和SOD活性

实验结束后，弃掉培养基，加入PBS洗3次，再加入200 μl含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液，4 ℃ 13 500 rpm离心15 min，吸取上清于EP管中，放入-80 ℃冻存。按照ELISA试剂盒的说明检测LDH、CK-MB、MDA含量和SOD活性。以空白孔调零，在酶标仪上设置450 nm波长测量各孔吸光度并计算最终浓度。

1.4 Western blot 法检测蛋白表达实验结束收集H9C2人心肌细胞,PBS洗3遍，加入200 μl含蛋白酶抑制剂的RIPA细胞裂解液，超声破碎细胞，4℃，13 500 rpm离心25 min，吸取上清于EP管中，放入-80℃冻存。取10 μl蛋白样品进行蛋白定量。取蛋白样品20 μg上样，10 % SDS-PAGE 电泳。用含5 %脱脂奶粉的封闭液封闭1 h 后，分别加入一抗GRP78(1∶1000)、Caspase-12(1∶1000)、Bax(1∶1000)、Bcl-2(1∶1000) 、SOD(1∶1000)和GADPH(1∶2000)，4℃孵育过夜，TBST洗3次，加入二抗(1∶5000)，室温孵育1 h，TBST洗3次，ECL显色，用凝胶图像分析系统进行扫描分析。

2 结果

2.1 各组LDH和CK-MB的水平

与正常对照组相比,H/R处理培养的H9C2人心肌细胞中LDH和CK-MB水平明显增加(P<0.05)；与H/R组相比，DLA可明显减少细胞中LDH和CK-MB的水平(P<0.05)。见表1。

表1 DLA对H/R 诱导的H9C2心肌细胞中LDH和CK-MB的影响

*P<0.05 vs.正常对照组；#P<0.05 vs.缺氧/复氧组。

2.2 各组MDA含量和SOD活性

与正常对照组相比,H/R处理培养的H9C2人心肌细胞中MDA含量明显增加，SOD活性明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1；与H/R组相比，DLA可明显减少细胞中MDA的含量，增加SOD活性，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2.3 免疫印迹法检测各组GRP78、Caspase-12和SOD蛋白水平

Western blot结果显示，与正常组相比，H/R组GRP78和Caspase-12蛋白表达水平明显增高，同时SOD蛋白表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；DLA抑制H/R诱导的细胞内GRP78、Caspase-12和SOD蛋白水平变化，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果见图2。

图1 DLA对H/R 诱导的H9C2心肌细胞中MDA和SOD活性的影响

图2 DLA对H/R 诱导的H9C2心肌细胞中GRP78、Caspase-12和SOD蛋白水平的影响

2.4 免疫印迹法检测各组凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2水平

Western blot结果显示:与正常组相比，H/R 诱导的H9C2心肌细胞中Bax蛋白表达水平明显增高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；DLA可抑制H/R 诱导的H9C2心肌细胞中Bax蛋白表达水平的增高和Bcl-2蛋白表达水平的降低(P<0.05)，结果见图3。

图3 DLA对H/R 诱导的H9C2人心肌细胞中Bax和Bcl-2蛋白水平的影响

3 讨论

通过溶栓或经皮冠状动脉介入治疗可以及早恢复心肌灌注，是减少心肌梗死面积、改善临床预后最有效的方法。然而缺血心肌血流恢复可能引起心肌缺血再灌注损伤[8]。诱发I/R的原因较为复杂，涉及细胞凋亡、氧化应激和钙超载等原因[9,10]。有研究表明，I/R能造成内质网应激和细胞凋亡[11]。对离体培养的心肌细胞缺氧/复氧可以在体外模拟心肌I/R。本实验结果发现：H/R可以诱导离体培养的H9C2人心肌细胞发生损伤，而丹参素可以改善H/R对H9C2细胞的损伤作用，其作用与其抑制H9C2细胞发生凋亡和内质网应激有关。

LDH和CK-MB是两种重要的心肌酶，其水平高低可反映细胞的受损程度[12,13]。本实验结果发现H/R可以诱导离体培养的H9C2细胞中LDH和CK-MB含量明显增加，而丹参素可以显著降低细胞中LDH和CK-MB的含量，提示丹参素可以减轻H/R诱导离体培养的H9C2细胞损伤。

作为氧自由基攻击生物膜的终产物，MDA含量高低可反映机体细胞受自由基损伤程度；抗氧化酶SOD活性高低可反映机体清除氧自由基的能力[14,15]。本实验结果显示，H/R可以诱导离体培养的H9C2细胞中MDA 含量显著增高，SOD 活性明显降低，表明H/R时细胞发生脂质过氧化，对氧自由基的清除能力降低；而丹参素可明显降低MDA 含量，增强SOD 活性，说明丹参素可通过增强机体对氧自由基的清除能力，减轻细胞膜脂质过氧化损伤而发挥心肌细胞保护作用。

内质网是真核细胞中的重要细胞器，参与蛋白质的折叠、组装和转运等。但在感染、炎症等不良刺激下内质网稳态被破坏，功能发生紊乱，大量错误折叠、未折叠蛋白在内质网腔内积累触发ERS[16,17]。GRP78是内质网分子伴侣蛋白，表达上调可以作为内质网应激的标志[18]。ERS造成组织细胞损伤也主要包括Caspase-12凋亡通路的激活[19]。本实验结果表明：H/R可以诱导离体培养的H9C2细胞中GRP78和Caspase-12含量明显增加，而丹参素可以显著降低细胞中GRP78和Caspase-12的含量，提示丹参素可以减轻H/R诱导离体培养的H9C2细胞发生的内质网应激。

细胞凋亡是心肌细胞缺氧/复氧损伤的重要指标，包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。其中Bcl-2和Bax分别属于抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。本研究结果显示：H/R可以诱导离体培养的H9C2细胞中Bcl-2蛋白含量明显降低，Bax蛋白含量明显增加；而丹参素可以显著降低细胞中Bcl-2蛋白含量的降低和Bax蛋白含量的增加，提示丹参素可以减轻H/R诱导离体培养的H9C2细胞发生的凋亡。

综上所述，丹参素对H/R诱导的心肌细胞损伤有一定的保护作用，该作用可能通过抑制Bcl-2蛋白含量的降低、Bax蛋白含量的增加、降低细胞中GRP78和Caspase-12的含量等机制，从而抑制心肌细胞发生凋亡和内质网应激，为其临床应用改善心肌缺血再灌注损伤提供了理论基础。