PCR技术在病原菌诊断中的研究进展

干 驰，莫 茜，陶 悦

(上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心·儿科转化医学研究所，上海200127)

传统病原菌检测方法如培养、形态学观察、生化鉴定等都存在耗时长、特异性差、灵敏度低等缺点。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，尤其是聚合酶链式反应(PCR)技术的出现，大大促进了病原菌检测技术的进步。该技术通过对病原菌特定基因片段进行指数级放大，进一步对扩增产物序列分析，可完成病原菌分类、鉴定，甚至提供抗生素耐药信息，不仅具有较好的特异性和灵敏性，还可将整个病原菌鉴定耗时缩减至一到两天甚至一个小时，对临床感染性疾病的高效快速诊断，合理使用抗生素具有指导意义。本文就PCR技术在病原菌诊断的应用原理、研究进展等做一综述。

1 普通PCR检测病原菌

1985年，Mullis发明了聚合酶链式反应技术[1]，通过体外模拟DNA合成过程，可以对目的基因片段进行指数级扩增。基于病原菌DNA或RNA检测的PCR技术，因其灵敏度高、特异性好、成本低、耗时较少等优点，逐渐成为临床实验室病原菌检测的重要手段之一。

1.1 通用引物扩增细菌16S rRNA基因检测细菌感染

16S rRNA是原核生物的一种核糖体RNA，是所有原核生物蛋白质合成所必需的。16S rRNA基因由保守区和高变区交错排列组成，保守区为所有细菌所共有，高变区在不同细菌间存在不同程度的差异，具有属或种的特异性。因此，可根据16S rRNA基因保守区设计细菌PCR检测的通用引物，也可根据可变区设计细菌的特异引物或探针。一方面其分子量大小适中，长度约1 500 bp[2]，适合作为PCR检测的目的基因，结合测序可以进一步明确细菌种属。另一方面，每个细菌含有5-10个16S rRNA基因拷贝，拷贝数较高，使得检测具有较高的敏感性。

Marin等通过16S rRNA基因PCR检测和传统微生物培养两种方法对321例假体关节样本进行检测，结果显示，两种方法灵敏度相当，但PCR检测特异性更高(100%/82%)，PCR检测阳性可以提示假体关节感染[3]。Guembe等通过普通PCR扩增16S rRNA基因检测219例静脉输液港表面薄膜样本，预测静脉输液港相关的血流感染，其灵敏度达到73.3%，特异性为87.3%，提示PCR检测静脉输液港相关的血流感染可作为传统培养法的一个有效补充[4]。但是，16S rRNA基因也因其高度保守，常常只能鉴定至属的水平，对于更明确的细菌分类则需要更精确的鉴定方法[5]。

1.2 通用引物扩增真菌26S rRNA 基因、ITS(Internal Transcribed Spacer)序列检测真菌感染

近年来，临床真菌感染问题越来越多，真菌检测对临床的诊断与治疗变得尤为重要，PCR技术也越来越多的应用于真菌的检测和鉴定中。真菌在进化过程中形成的一些特殊DNA序列常作为PCR的检测靶标，例如真菌26S rRNA 基因D1/D2 区位于真菌核糖体大亚基基因的5′端，长度约600 bp，具有较高的变异率，因此通过PCR扩增该区域并进行序列分析，可鉴定真菌感染。此外，真菌ITS区域为转录间区，不同真菌的ITS区间的长度和序列则差异较大，因此ITS序列常被用于区分亲缘关系较近的真菌。

Hesham等通过PCR检测念珠菌分离株26S rRNA基因 D1/D2序列，序列分析显示与Genebank数据库中6种念珠菌高度同源，匹配度达到99%-100%，结合变性凝胶电泳技术可根据电泳条带大小直观鉴别出六种念珠菌[6]。Rampini等比较了251例非免疫功能缺陷患者临床标本的ITS PCR结果与真菌培养结果，其一致性达到了89.6%。以培养为金标准，ITS PCR分析的灵敏度和特异度分别达到87.7%和90.3%，阳性和阴性预测值分别为76%和95.5%，且与培养相比，ITS PCR检测耗时仅为两个工作日，对于罕见真菌的鉴定、及时抗真菌治疗等应用具有明显优势[7]。

1.3 特异性引物扩增特异基因鉴定病原菌种类

通用引物PCR检测病原菌需结合测序才能明确细菌或真菌种类，而特异性引物PCR可通过检测病原菌特异表达基因，避免对其他种属微生物或宿主基因产生交叉反应，因此可直接鉴别病原菌，无需结合测序。最常见的特异性检测是mecA 基因的扩增，以筛选甲氧西林耐药。王锦萍等利用PCR扩增检测30株肺结核并发感染凝固酶阴性葡萄球菌，其mecA基因检出率达到100.0%，耐药表型与耐药基因型的检出率高度一致[9]。Brakstad等利用普通PCR检测金葡菌热稳定核酸酶基因nuc(270 bp DNA片段)，可检出最低10个菌落形成单位(Colony-Forming Units，CFU)金葡菌或0.69 pg基因组DNA，在临床金葡菌感染快速诊断中具有较好的前景[8]。但是利用特异性引物PCR检测病原菌其一次反应仅可检测一个目的基因，而临床病原菌种类繁多，对于临床病原菌快速诊断价值有限[10]，仅在PCR技术发明早期少量应用于病原菌检测，现如今主要应用于科研单位研究或作为开发多重PCR技术的基础。

2 多重PCR检测病原菌

多重PCR技术原理与普通PCR无异，区别在于反应体系中至少有两对特异性引物[11]，同时检测多个基因，大大提高了病原菌鉴定的效率[10]。多重PCR仅需一次反应即可完成多个病原菌或耐药基因的检测，其对于社区医院或测序服务不完善地区的临床病原菌分子诊断方面具有独特的优势。目前已有多种多重PCR系统逐步应用于临床，成为当下病原菌快速诊断的主流工具。具体见表1。

3 实时荧光定量PCR检测病原菌

普通PCR只能定性或半定量检测临床样本中的病原菌DNA。实时荧光定量PCR则利用荧光染料或探针，在扩增过程中实时监测荧光信号，并通过制定标准曲线准确定量样本目的基因的初始拷贝数，已经成为临床部分病原菌检测的常规手段。2018年，Bispo等开发验证了一项多重实时荧光定量PCR技术，可用于快速检测葡萄膜炎样本中的常见病毒：单纯疱疹病毒1型和2型(HSV-1和HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、巨细胞病毒(CMV)和刚地弓形虫。研究人员对比验证了30例感染性葡萄膜炎样本和78例对照样本，发现该检测方法灵敏度较高，单纯疱疹病毒和弓形虫的检测下限分别可达20和 200个拷贝，且所有的扩增均得到了测序验证。提示该方法可以快速、灵敏、可靠地检测和识别传染性葡萄膜炎常见病原体[19]。对于遗传物质是RNA的病原菌如HIV病毒、登革热病毒和寨卡病毒等，则需将RNA逆转录形成DNA后再进行检测[20]。美国Cepheid公司基于实时荧光定量PCR原理，开发了GeneXpert系列平台，可快速检测结核分枝杆菌及利福平耐药情况[21]、耐甲氧西林金黄葡萄球菌、艰难梭菌毒素等，从原始标本采集到结果获得仅需1-2小时，灵敏度超过了93%，显示出良好的应用前景[22]。

表1 基于多重PCR原理的病原菌或耐药基因检测新工具

注：“/”未见相关报道

4 数字PCR(digital PCR)检测病原菌

数字PCR又称单分子PCR，是PCR技术的最新研究进展，具有高灵敏度和精确性等优势，其原理是将单个DNA分子置于独立的反应器中(微滴或芯片等)，进行PCR扩增，通过读取荧光信号，利用统计学方法计算样本目的DNA初始拷贝数[23,24]。与实时荧光定量PCR相比，数字PCR不需要制定标准曲线，省时省力。有研究将数字PCR与实时荧光定量PCR相结合(RT-ddPCR法)对戊型肝炎病毒RNA进行检测和定量，显示出较高的灵敏度[25]。Srisutham等利用数字PCR检测血流疟原虫感染并对其进行绝对定量，结果显示该数字PCR系统对血流中疟原虫属的检测下限可达到11个/ml[26]。数字PCR也是当下唯一可以实现病原菌目的基因拷贝数绝对定量的PCR方法，但其成本较高，尚没有得到普及[27]。未来如能降低成本，并进一步实现操作智能化，数字PCR将在临床病原菌检测中发挥更加重要的作用。

5 展望

PCR技术具有灵敏度高、特异性强的特点，作为分子诊断的基础，已经证明了其在病原菌诊断中的价值。伴随着实验技术和方法的快速发展， PCR技术已经一定程度降低了以往病原菌检测对传统培养技术的依赖，并成为传统培养技术的有效补充。但是，正因为PCR法较高的敏感度，也对临床样本采集和实验环境提出了更高要求。此外，相关试剂仪器设备高昂的价格和严苛的实验环境依然是其在社区医院或偏远地区应用的障碍。任何一项病原菌检测技术都有其优缺点，所以PCR技术仍值得更深入的研究和更广泛的推广使用。