脑胶质瘤组织中细胞周期蛋白B2的表达变化及其与患者临床病理特征、预后的关系

赵亚运，张墨轩，潘景臻，司茂飞，赵志明，张健

1山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东泰安271000；2临沂市人民医院；3潍坊医学院

脑胶质瘤是起源于神经胶质细胞的常见原发性脑肿瘤，占大脑和中枢神经系统恶性肿瘤的30%，并且以多形性胶质母细胞瘤(GBM)为主，患者的中位生存期不到15个月[1,2]。近年来研究发现，O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子甲基化、IDH基因变异、染色体1p/19q共缺失、TERT启动子变异等均有助于脑胶质瘤的临床诊断、预后及化疗敏感性判断，但其敏感度和准确度有限[3,4]。细胞周期蛋白B2(CCNB2)属于B型细胞周期家族蛋白，位于染色体15q22.2，与细胞周期依赖型激酶(CDKS)结合调节CDKS活性，不同的细胞周期蛋白在细胞周期的特定阶段具有时空特性[5]。CCNB2通过激活细胞分裂周期蛋白激酶2(CDK2)，参与真核细胞周期中的G2/M期转化。研究表明，CCNB2过表达与结直肠癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展有关[6～8]，但其在脑胶质瘤组织中的表达变化及其与患者临床病理特征、预后的关系尚不清楚。为此，我们进行了如下研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2008年6月～2014年6月于临沂市人民医院神经外科首次接受手术治疗的脑胶质瘤患者65例作为观察组，男32例、女33例，年龄4～70岁、中位年龄44岁；肿瘤部位：额叶40例，颞叶16例，其他9例；KPS评分：<80分34例，≥80分31例；WHO分级：Ⅰ～Ⅱ级31例，Ⅲ～Ⅳ级34例；肿瘤直径：<4 cm 21例，≥4 cm 44例；p53基因型：野生型38例，突变型27例；Ki-67表达：阳性27例，阴性38例。患者均经术后病理证实；排除术前行放疗、化疗及免疫治疗者，合并心、肝、肾等功能不全者，合并其他肿瘤者，肿瘤直径太小无法获取标本者。选择同期因颅脑外伤行颅内减压手术的患者30例作为对照组，男15例、女15例，年龄5～70岁、中位年龄44岁。两组性别、年龄均具有可比性。本研究通过医院伦理委员会审核，患者或其家属签署知情同意书。

1.2 脑组织CCNB2检测方法 采用免疫组化法。观察组术中收集脑胶质瘤组织，对照组术中收集切除的脑组织。将两组脑组织进行石蜡包埋，4 μm厚度切片，70 ℃烤箱中烘烤1 h，二甲苯脱蜡，顺浓度梯度乙醇水化。将脱蜡水化后的切片置于10 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH值为6.0)中，微波加热进行抗原修复，自然冷却至室温。滴加阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10 min，PBS缓冲液冲洗2 min×3次；滴加CCNB2抗体(1∶100)，37 ℃条件下孵育3 h，PBS缓冲液冲洗2 min×3次。滴加反应增强液，室温孵育20 min，PBS缓冲液冲洗2 min×3次。滴加抗鼠/兔IgG二抗，室温下孵育20 min，PBS缓冲液冲洗2 min×3次。加入适量新鲜配制的二氨基苯胺(DAB)，室温暗箱孵育3～5 min，加水终止显色。流动水冲洗，苏木素、盐酸乙醇分化液和氨水返兰复染，脱水、透明、封片后显微镜观察。免疫组学分析和评分均由2名病理科医师独立完成，以细胞质和(或)细胞核中出现棕黄色颗粒定义为阳性染色，根据染色强度(0～3级)和阳性细胞比例(0～100%)进行评分。评分标准：染色强度0级评分为0分，染色强度2级、阳性细胞比例<10%评分为2分，染色强度1级、阳性细胞比例>50%评分为3分，染色强度2级、阳性细胞比例10%～50%评分为4分，染色强度2级、阳性细胞比例>50%评分为5分，染色强度3级、阳性细胞比例100%评分为6分。评分>4分定义为CCNB2阳性表达。

1.3 随访方法 观察组术后随访记录生存时间，生存时间定义为从诊断之日起至脑胶质瘤相关死亡的时间间隔。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验或秩和检验；采用Kaplan-Meier法绘制观察组脑胶质瘤组织CCNB2表达阳性与阴性患者的生存曲线，生存时间比较采用Log-Rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组脑组织CCNB2阳性表达率比较 观察组脑胶质瘤组织CCNB2阳性表达率为50.8%(33/65)，对照组脑组织CCNB2阳性表达率为16.7%(5/30)，两组比较P<0.01。

2.2 观察组脑胶质瘤组织CCNB2表达与患者临床病理特征的关系 观察组脑胶质瘤组织CCNB2阳性表达与患者WHO分级、p53基因型、Ki-67表达均有关(P均<0.05)。观察组脑胶质瘤组织CCNB2阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤位置、KPS评分、肿瘤直径均无关(P均>0.05)。见表1。

2.3 观察组脑胶质瘤组织CCNB2表达与患者预后的关系 观察组脑胶质瘤组织CCNB2阳性表达患者生存时间为(44.0±5.7)月，阴性表达患者为(81.0±6.4)月，两者比较P<0.01。

3 讨论

脑胶质瘤的发病原因很多，脑内遗传因素和残留的胚胎原始细胞是导致脑胶质瘤发生的重要内源性影响因素，有害的理化因素以及病毒感染则是外源性因素。目前脑胶质瘤的发病机制尚不清楚，Rb、p53和受体酪氨酸激酶(RTK)信号通路等在脑胶质瘤尤其在GBM的发生过程中具有重要作用[9]，调控这些通路的基因和蛋白不仅可以作为脑胶质瘤的治疗靶点和诊断标志物，还可以用来评估脑胶质瘤的病理特征。B型细胞周期蛋白家族包括CCNB1和CCNB2。在分裂间期，CCNB1持续在细胞核和细胞质间穿梭；在分裂间期末，CCNB1快速进入细胞核，并与有丝分裂体结合；与之相反，在分裂间期和有丝分裂期，CCNB2会穿出细胞核，逐渐靠近高尔基体。尽管CCNB1和CCNB2在细胞内的定位不同，但是两者共同发挥促使细胞进入G2/M期的重要功能。CCNB2与CDK2相互作用，形成丝氨酸/苏氨酸激酶合酶复合物，称为成熟促进因子(MPF)。CCNB2在G1期合成，一般通过激活CDK2激酶触发G2/M转化，然后在前中期和后期表达迅速下降，抑制CCNB2表达可以诱导细胞周期停滞[10]。在正常情况下，CCNB2表达受到严格调控，但在一些恶性细胞中CCNB2降解受到抑制，导致CCNB2过表达，CCNB2的异常表达可导致G2/M期调节点修复受损DNA和维持基因组完整的功能失常，由此导致基因突变和肿瘤发生[10]。

表1 观察组脑胶质瘤组织CCNB2表达与患者临床病理特征的关系

研究表明，CCNB2在胃癌、上皮性卵巢癌和弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中表达上调[11～13]。与正常对照组相比，肺癌和消化道肿瘤患者血清CCNB2 mRNA表达升高，并与癌症分期和转移状态有关[14]。有研究基于KEGG、PPI网络和WGCNA分析中的重复基因，筛选出CCNB2可作为脑胶质瘤的候选诊断标记基因[15]。研究表明，在脑胶质瘤组织和星形胶质细胞瘤组织中CCNB2 mRNA和蛋白表达均升高[16]。本研究显示，观察组脑胶质瘤组织中CCNB2阳性表达率明显高于对照组，表明CCNB2表达升高可能参与了脑胶质瘤的发生。Ki-67是一种存在于增殖细胞的核抗原，表达于细胞周期的G1/M期，在G0期表达受到抑制，是细胞进入增殖周期的标志物。 Ki-67是应用最广泛的细胞增殖标志物之一，Ki-67阳性率越高表明处于增殖周期的细胞越多，肿瘤生长越快，组织分化越差。p53可分为野生型和突变型，野生型p53是一种快速诱导受损细胞凋亡的抑癌基因，可防止具有潜在癌变潜能的细胞发生癌变，发挥抗癌作用。野生型p53一旦发生突变，就不再具有抑瘤作用，反而会加速癌细胞的增殖和生长。当野生型p53转化为突变型p53时，突变型p53作为原癌基因在肿瘤细胞中长期存在，最终导致肿瘤发生。本研究结果显示，观察组脑胶质瘤组织CCNB2阳性表达与患者WHO分级、p53基因型、Ki-67表达均有关，与患者性别、年龄、肿瘤位置、KPS评分、肿瘤直径均无关，且CCNB2阳性表达与肿瘤增殖指标Ki-67及突变型p53表达有关，提示CCNB2在脑胶质瘤的发展过程中发挥促瘤作用。

Shubbar等[8]研究表明，CCNB2蛋白过表达与乳腺癌患者的短期疾病特异性生存(DSS)密切相关，是乳腺癌患者DSS的独立预测指标。Takashima等[17]研究表明，CCNB2 mRNA高表达的肺腺癌患者总体生存率低于CCNB2 mRNA低表达者。还有研究表明，CCNB2过表达提示非小细胞肺癌患者预后不良[7]。本研究结果显示，观察组脑胶质瘤组织CCNB2阳性表达患者生存时间明显短于阴性表达患者，说明脑胶质瘤组织CCNB2表达升高提示患者生存时间短、预后较差。

综上所述，脑胶质瘤组织中CCNB2蛋白表达升高，CCNB2蛋白表达升高可能参与了脑胶质瘤的发生与发展，并提示患者预后不良。