慢性乙型肝炎患者外周血NK细胞杀伤细胞凝集素样受体G1表达及其对NK细胞杀伤功能的影响*

殷智颖，张 野，徐土炳

目前，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者已经在全球范围内广泛存在[1]，其中非洲和亚洲范围内流行率较高。根据世界卫生组织(WHO)报道，全世界约有20亿人群曾经感染过乙型肝炎病毒(hepatitis B, HBV)，而约2.4亿人为CHB患者。HBV感染是导致肝硬化和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的主要原因[2，3]。全世界每年约有65万人因肝功能衰竭、肝硬化或HCC而死亡[4，5]。血清HBeAg是HBV复制和传染的标志，与HBV DNA呈正相关[6]。临床上，一般将HBV感染分为免疫耐受期、免疫清除期、非活动期和再活动期等期相[7]。HBV复制和宿主免疫力受损将导致疾病发作[8]。由于CHB患者固有免疫系统受到损害，导致机体不能有效清除病毒，从而发生慢性持续性感染。自然杀伤细胞(nature killer cells, NK细胞)主要集中在肝脏内。在肝脏，NK细胞占淋巴细胞的三分之一，而在外周血中只占5%～15%[9]。NK细胞在免疫系统中是清除病原体和异常细胞的效应细胞，可以通过杀伤功能和分泌细胞因子而发挥作用。国内外研究发现CHB患者NK细胞数量减少，其分泌细胞因子的功能受损，因而NK细胞是研究CHB患者发病机制和治疗方案选择的重要依据。杀伤细胞凝集素样受体亚家族G成员1(killer cell lectin-like receptor subfamily G member 1, KLRG1)是在大鼠黏膜肥大细胞株中首次被发现，是一类可以抑制炎症介质释放的受体。在人体，KLRG1主要表达于NK细胞和T细胞[10]。目前，已有学者研究发现丙型肝炎患者外周血NK细胞KLRG1表达可以导致NK细胞频数减少和功能损害[11]，可能与HCV抑制了NK细胞的复制，促进NK细胞凋亡，并抑制NK细胞释放炎性细胞因子有关。本研究检测了CHB患者外周血KLRG1阳性NA细胞百分比及其NK细胞杀伤功能的变化，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2017年3月～2019年3月我院收治的CHB患者120例，男性87例，女性33例；年龄28～63岁，平均年龄为(43.7±5.4)岁。诊断符合2015年中华医学会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》。排除标准：①肝硬化、肝功能衰竭或肝脏恶性肿瘤；②合并有酒精性肝病、自身免疫性肝病、药物性肝损伤；③合并有甲型、丙型、丁型肝炎、人类免疫缺陷病毒(HIV)、EB病毒或巨细胞病毒感染；④孕妇或哺乳期女性。另选择健康体检者120例，男性77例，女性43例；年龄30～62岁，平均年龄为(42.5±5.2)岁。本研究经我院医学伦理委员会审核同意，入组人员签署知情同意书。

1.2 外周血NK细胞百分比检测 采集外周静脉血，抗凝，12000 r/m离心10 min，弃去上清液，与等量D-Hanks液均匀稀释，应用Ficoll淋巴细胞分离液(TBD公司)，分离单个核细胞。取细胞加入EP管，分别加入Percp-5.5标记的抗人CD3抗体、FITC标记的抗人CD56抗体、APC标记的抗人KLRG1抗体(eBiosicence公司)，避光放置30 min，洗涤，并重悬于流式管中，使用流式细胞仪(美国BECKMAN公司)检测。

1.3 分泌γ-干扰素的NK细胞检测 取单个核细胞，加入96孔板，每孔2×105个细胞，体积约100μL。加入含胎牛血清(澳洲Hyclone公司)的1640培养液100μL，每孔分别加入100 ng/mL丙二醇甲醚醋酸酯(PMA，联科生物公司)和1μg/mL离子霉素(联科生物公司)培养2 h。然后，加入1μg/mL布雷菲德菌素A，培养4 h，以阻断细胞因子的分泌。将细胞转入EP管，加入Percp-5.5标记的抗人CD3抗体、FITC标记的抗人CD56抗体、APC标记的抗人KLRG1荧光抗体标记，使用BD公司提供的试剂盒固定细胞并透化，洗涤细胞2次，用PECY 7-IFN-γ(eBiosicence公司)染色，再上流式细胞仪检测分泌γ-干扰素的NK细胞比例。

1.4 NK细胞表型分子检测 调整PBMCs浓度为5×106/ml, 取100μl置于流式管中, 加入表型抗体 (抗CD38、抗CD69、抗HLA-DR、抗TRAIL) ，混匀，室温避光孵育25 min。加入PBS 1 ml， 混匀, 400×g离心、洗涤5 min。弃上清，拍干。加入破膜剂300μl/管，4℃避光破膜30 min。用破膜洗液离心洗涤，加入胞内抗体 (抗perforin、抗Granzyme A和抗Granzyme B)，室温避光孵育25 min。加入破膜洗液，离心洗涤后弃上清，拍干。用1%多聚甲醛液200μl重悬细胞， 4℃避光保存，24 h内上流式细胞仪检测。

1.5 NK细胞杀伤实验 取纯化的外周血NK细胞, 按20万/孔铺于96孔圆底细胞培养板, 同时加入LX-2细胞 2×104个/孔, 置37℃、CO2细胞培养箱共培养6 h，收集细胞，检测LX-2细胞凋亡情况，用预冷的PBS收取细胞至流式管中，离心洗涤后每管加入Annexin-V缓冲液100μl，重悬细胞，加入抗Annexin-V荧光抗体, 室温避光染色5 min，加入7AAD荧光抗体, 室温避光染色10 min。每管加入Annexin-V缓冲液100μl，终止染色, 立即上流式细胞仪检测。

2 结果

2.1 两组外周血NK细胞百分率比较 CHB患者外周血NK细胞和KLRG1+NK细胞百分比显著高于，而分泌IFN-γ的NK细胞百分率显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 两组外周血NK细胞百分率比较

与对照组比，①P<0.05

2.2 两组外周血NK细胞表型比较 CHB患者外周血NK细胞活化程度增高，NK细胞CD38、CD69、HLA-DR和TRAIL表达均显著高于对照组(P=0.012，P=0.015，P=0.025，P=0.019,图1)。

图1 两组外周血NK细胞表型比较

2.3 两组NK细胞杀伤能力比较 CHB患者NK细胞诱导LX-2细胞发生早期凋亡率为11.5%(6.6%～13.7%)，晚期凋亡率为7.2% (5.1%～8.5%)，与对照组的15.4% (11.5%～24.3%)和13.5% (8.1%～20.4%) 比，显著降低 (U=6.50,P=0.025；U=2.02，P=0.002，图2) 。

图2 NK细胞对LX-2细胞的杀伤能力比较

3 讨论

在急性HBV感染阶段，患者的免疫能力瞬时发挥作用，同时引发相应的特异性免疫反应，在成人可导致感染的终止[12-14]。免疫系统对病原体识别主要是通过病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)而完成[13-17]，也称为病原体识别受体(pathogen recognition receptors, PRR)。PRR有许多种类，如Toll受体、维甲酸诱导性基因I受体(RIG)、核苷酸结合寡聚化结构域蛋白质受体(NOD)、C型凝集素和DNA感应受体，这些受体通常在各自相应的上皮细胞/内皮细胞、特异/非特异免疫细胞中表达。一旦PRR与相应PAMP结合后，下游信号通路便会随之激活，如衔接子和共衔接子、激酶、转录因子[18]等。转录因子中包含干扰素调节转录因子。在信号通路激活后，干扰素刺激基因变化开始表达，从而形成各类干扰素[19]、促炎性细胞因子、趋化因子[20]等。本研究中，通过γ干扰素的分泌来分析NK细胞的功能。NK细胞在抵御病原体侵入时位于第一道防线，其数量减少会导致患者对于HBV的免疫能力下降。抵抗病毒的干扰素减少。本研究中，CHB患者分泌γ干扰素的NK细胞比例明显低于对照组(P< 0.05)。

KLRG1在细胞质结构含有免疫受体，为酪氨酸抑制性基序(ITIM)，在细胞外区域则含有凝集素样结构域，属于跨膜蛋白。KLRG1属于钙粘蛋白受体，而E-钙粘蛋白受体在外周血细胞表达，在髓样树突状细胞(DC)上则没有发现N-钙粘蛋白受体。KLRG1通常在人体NK细胞和T细胞表达，是一种抑制性受体。年轻人CD8+T细胞上KLRG1表达约为40%，在CD4+T细胞上表达约为20%。随着年龄的增长，KLRG1在CD8+T细胞上的表达也会明显增加。到65岁时，其表达可达90%。表达KLRG1的T细胞增殖能力减弱。近些年来，已经有研究表明艾滋病毒、巨细胞病毒和疱疹病毒重复刺激可以增加CD8+T细胞上KLRG1的表达。对于NK细胞上KLRG1的表达研究还不够清楚。本研究中，CHB患者PBMC中KLRG1+NK细胞的比例增加，同时，CHB患者分泌γ干扰素的NK细胞比率明显比健康人减少。

自2006年在小鼠模型上证实NK细胞可通过NKG2D和TRAIL依赖方式杀伤活化的肝星状细胞(HSCs)以来，发现其能抑制肝纤维化【21】，NK细胞的抗纤维化作用即被广泛关注。目前认为NK细胞抗纤维化功能主要包括杀伤活化的HSCs和分泌IFN-γ，诱导HSCs凋亡及阻滞细胞周期等[22,23]。本研究通过检测分泌IFN-γ的NK细胞频数及NK细胞在体外对LX-2细胞的直接杀伤能力来反映NK细胞的抗纤维化功能，结果发现，CHB患者外周血分泌IFN-γ的NK细胞频数与对照组相比显著降低。与此同时，CHB患者NK细胞诱导LX-2细胞发生早期凋亡和晚期凋亡的比例均显著低于对照组，即CHB患者外周血NK细胞对LX-2细胞的杀伤能力减弱。这些结果提示CHB患者NK细胞处于抗纤维化功能受损状态。

尽管本研究经过严格的实验设计，但是各种检测依赖的技术水平较高，很难保证结果的可靠性，需重复实验验证。另外，针对KLRG1的研究尚属探索阶段，有待于未来更大样本、更细致的深入研究。尽管如此，本研究发现CHB患者外周血KLRG1+NK百分率增高，而分泌γ-干扰素的功能降低，这次发现可能影响CHB患者的疾病转归和治疗方案的选择，因而是非常重要的。