热打击诱导肝细胞释放的外泌体生物学功能及其致肝损伤作用分析

李悦，祝鑫桃，张明，梁泳欣，施学智，童华生*

1解放军南部战区总医院重症医学科/解放军热区损伤与组织修复重点实验室，广州 510010；2广州医科大学第六附属医院/清远市人民医院重症医学科，广东清远 511500

外泌体是细胞外囊泡的一种，可介导各种生物活性分子(如蛋白、脂质、mRNA和microRNA)在细胞间传递并影响靶细胞的功能，构成新的细胞间信息传递系统[8-10]。外泌体因其稳定性高，膜结构保护内含物不易降解，作用时间窗宽及疾病、脏器特异性高等特点，作为细胞间相互作用方式具有很大优势[11]。肝细胞是肝脏的主要外泌体分泌细胞，且相对易损，可最早感受到各种损伤应激因素。肝细胞不但是被动损伤的靶点，还通过释放“危险信号”的方式积极主动参与肝损伤[12]。不同于免疫细胞直接释放炎性因子作为危险信号，实质细胞如肝细胞等释放危险信号的主要方式为对内源性细胞组分的“再利用”，如损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern，DAMP)[13]。肝细胞外泌体损伤应激后分泌的一种DAMP在各种肝脏病理生理机制中发挥着重要作用，可介导肝损伤[14-15]。但肝细胞外泌体在重症中暑合并急性肝损伤中的作用目前尚不清楚。本研究拟对中暑后肝细胞释放的外泌体进行鉴定，进行蛋白质谱KEGG通路分析并验证中暑诱导的肝细胞来源的外泌体是否参与重症中暑肝损伤。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 人肝癌细胞系HepG2细胞购自上海细胞库。42只6～8周龄健康雄性C57BL/6小鼠(20～25 g)购自广东省医学实验动物中心。胎牛血清(FBS)、DMEM购自美国Life Technologies公司。BCA测定试剂盒购自美国Themo Fisher Scientific公司。Fomvar Carbon铜网购自加拿大Mecalab公司。透射电子显微镜(型号2100F)购自日本JEM公司。纳米粒子跟踪分析仪(型号NS300)购自英国Worcestershire公司。外泌体PKH67绿色荧光染料试剂盒购自美国Sigma Aldrich公司。CD63抗体(型号ab10895)和CD9抗体(型号ab92726)购自英国Abcam公司。CD81抗体(型号18250-1-AP)和GAPDH抗体(型号60004-1-Ig)购自美国Proteintech公司。抗山羊、抗兔或抗小鼠二抗购自美国Li-cor公司。GW4869(外泌体释放抑制剂)购自美国Sigma公司。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 供体肝细胞外泌体的分离及鉴定

1.2.1 供体肝细胞培养及分组 将人肝癌细胞系HepG2细胞在含10%FBS的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。将细胞分为对照组(不做任何处理)与热打击组(将HepG2细胞更换无血清培养基，24 h后放入43 ℃高温培养箱处理1 h，立即转移至37 ℃孵箱复温9 h)两组。

1.2.2 外泌体分离 收集对照组和热打击组肝细胞上清，低速离心去除细胞、死细胞及细胞碎片。随后300×g、4 ℃离心10 min，弃沉淀(细胞)，收集上清至50 ml离心管。2000×g、4 ℃离心20 min，弃沉淀(死细胞)，收集上清至50 ml离心管。10 000×g、4 ℃离心30 min，弃沉淀(亚细胞成分)，收集上清至50 ml离心管。0.22 μm过滤器过滤1次，去除凋亡小体、微囊泡和细胞碎片。将上清转移至超高速离心机，100 000×g、50.2 Ti转子(k因子：157.7)，4 ℃离心70 min沉淀外泌体。小心吸去上清，留高于沉淀2 mm的上清。将含有外泌体的沉淀加入1 ml预冷PBS重悬，100 000×g、4 ℃离心70 min，沉淀加入30～100 μl PBS重悬，收集至1.5 ml EP管中。

医生根据患者的年龄、性别、生活习惯、身体状况，为患者设定预警值；当患者数据超过预警值，系统将发出警报，自动推送预警信息；系统根据需要，将患者某一时间段内某个指标的历史变化和预警值，绘制到一张图上，进行直观展示；用户可以选择时间段，查询患者的历史预警记录。

1.2.3 透射电子显微镜观察外泌体形态 将外泌体加入Fomvar Carbon铜网中，1%戊二醛固定，1%草酸双氧铀染色，用透射电子显微镜观察外泌体形态。

1.2.4 纳米颗粒追踪分析(NTA)检测外泌体的粒径及浓度 通过纳米粒子跟踪分析仪测量外泌体直径和浓度分布，按说明书操作。外泌体样品用无菌PBS稀释(1:5000)，每个样品分析60 s，Nanosight自动分析设置测量3次。

1.2.5 Western blotting检测特征表面标记物的表达水平 取等量外泌体沉淀或细胞裂解物加入5×上样缓冲液并煮沸，并在12%SDS-PAGE凝胶上分离。蛋白质转移到PVDF膜上，室温下5%BSA封闭1 h。PVDF膜4 ℃与CD63、CD9、CD81和GAPDH一抗孵育过夜。TBST缓冲液洗涤膜3次，室温下与抗山羊、抗兔或抗小鼠二抗温育1 h。TBST缓冲液洗涤膜3次，使用Odessy系统检测蛋白质信号，Gel软件进行定量分析。

1.3 外泌体标记及体内外摄取实验

1.3.1 外泌体标记 PKH67标记肝细胞外泌体：用PBS稀释外泌体后加入4 μl PKH67染料温育4 min。随后加入2 ml 0.5%的BSA，100 000×g离心洗涤标记外泌体1 h，得到外泌体沉淀用于体外体内摄取实验。

1.3.2 体外摄取实验 将受体肝细胞分为PKH-67外泌体刺激组(刺激组)与对照组。刺激组：加入10 μg PKH67标记外泌体；对照组：加入1 ml无菌PBS。6 h后用共聚焦显微镜观察外泌体摄取情况。

1.3.3 体内摄取实验 将小鼠分为PKH-67外泌体输注组(输注组)与对照组，每组6只。输注组：尾静脉注射40 μg PKH67标记的外泌体；对照组：尾静脉注射5 ml无菌PBS。4 h后处死，取小鼠肝组织行冰冻切片，用共聚焦显微镜观察外泌体摄取情况。

1.4 肝细胞外泌体等重同位素多标签相对定量蛋白质组学(iTRAQ)分析

1.4.1 样品制备 将对照组或热打击肝细胞外泌体加入适量SDT裂解液，沸水浴15 min。14 000×g离心15 min后，取上清。采用BCA试剂盒法对蛋白进行浓度测定。将样品分装后，于-80 ℃保存。

1.4.2 SDS-PAGE蛋白电泳 各组样品取20 μg蛋白质，分别加入1/4体积的5×上样缓冲液，沸水浴10 min，行12%SDS-PAGE电泳(恒压250 V，40 min)，考马斯亮蓝染色。

1.4.3 FASP酶解 取30 μl各组样品的蛋白质溶液，分别加入适量DTT至终浓度100 mmol/L，沸水浴5 min，冷却至室温；加入200 μl尿酸缓冲液混匀，转移至30 kD超滤离心管中，14 000×g离心15 min后吸弃滤液(该步骤重复1次)；加入100 μl IAA缓冲液，600 r/min振荡1 min，室温下充分反应30 min后(避光)，14 000×g离心5 min；加入100 μl尿酸缓冲液，14 000×g离心15 min(该步骤重复2次)；加入100 μl 10倍稀释的溶解缓冲液，14 000×g离心15 min(该步骤重复2次)；加入40 μl胰酶缓冲液，600 r/min振荡1 min，37 ℃孵育16～18 h；更换新的收集管，14 000×g离心15 min，再加入40 μl 10倍稀释的溶解缓冲液，14 000×g离心15 min后收集滤液。用Nano Drop 2000对样品进行肽段定量。

1.4.4 iTRAQ标记 各样品分别取100 μg肽段，按照iTRAQ标记试剂盒进行标记。

1.4.5 High PH RP分级 将每组标记后的肽段混合后，采用Agilent 1260 infinity II HPLC系统进行分级。缓冲液A液为10 mmol/L HCOONH4，5%ACN，pH值10.0，B液为10 mmol/L HCOONH4，85%ACN，pH值10.0。色谱柱以A液平衡，样品由手动进样器上样到色谱柱进行分离，流速为1 ml/min。液相梯度如下：0～25 min，B液0%；25～30 min，B液线性梯度从0%～7%；30～65 min，B液线性梯度从7%～40%；65～70 min，B液线性梯度从40%～100%；70～85 min，B液维持在100%。洗脱过程中监测214 nm的吸光度值，每隔1 min收集洗脱组分，共计收集洗脱组分约36份。根据实验需要将样品冻干后用0.1%FA复溶，合并为3份。

1.4.6 质谱分析

1.4.6.1 Easy nLC色谱 每份样品采用纳升流速Easy nLC系统进行分离。缓冲液A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为80%)。色谱柱以100%的A液平衡，样品由自动进样器上样到分析柱(Thermo Scientific公司，Acclaim PepMap RSLC 50 μm×15 cm，nano viper，P/N164943)分离，流速为300 nl/min。选择2 h液相梯度：0～5 min，B液线性梯度从0%～6%；5～105 min，B液线性梯度从6%～28%；105～110 min，B液线性梯度从28%～38%；110～115 min，B液线性梯度从38%～100%；115～120 min，B液维持在100%。

1.4.6.2 质谱鉴定 色谱分离后，利用Q-Exactive Plus质谱仪对样品进行质谱分析。分析时长为60/120 min(根据实验需要而定)，检测方式为正离子，母离子扫描范围350～1800 m/z，一级质谱分辨率为70 000，AGC目标为3×106，一级IT最大值为50 ms。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集10个碎片图谱。

1.4.7 数据分析 原始数据用Mascot 2.5及Proteome Discoverer 2.1软件进行查库鉴定及定量分析。

1.5 外泌体刺激受体肝细胞实验 将受体肝细胞分为对照组、正常肝细胞外泌体刺激组(正常刺激组)、热打击肝细胞外泌体刺激组(热打击刺激组)、热打击组及热打击+GW4869预处理组(热打击预处理组)。热打击组参照1.2.1方法进行处理；热打击预处理组在热打击前2 h用GW4869(20 μg/ml培养上清)预处理，抑制内源性外泌体；两个刺激组分别加入正常肝细胞外泌体或热打击肝细胞外泌体(10 μg/5 ml培养上清)作用24 h；对照组不进行热打击或外泌体刺激处理，其他步骤相同。按试剂盒说明书检测各组ALT、AST和LDH水平。

1.6 外泌体体内回输刺激实验 将小鼠分为对照组、正常肝细胞外泌体输注组(正常输注组)、热打击肝细胞外泌体输注组(热打击输注组)、热打击组及热打击+GW4869预处理组(热打击预处理组)，每组6只。实验间期自由进食饮水，12 h交替光/暗控制。严格按照现行伦理规定及指南进行动物实验。两个输注组分别经尾静脉输注正常肝细胞外泌体或热打击肝细胞外泌体(40 μg/只)，作用24 h。热打击组：于热打击前20 min禁食禁水，将小鼠置于孵育箱，温度在30 min内升高至39.0 ℃，相对湿度为60%；在直肠中插入1～5 cm肛温计，间隔10 min测量核心温度(Tc)，Tc达42.5 ℃时，认为中暑发生；将小鼠从孵育箱中取出称重，室温下自由饮水进食，9 h后处死。热打击预处理组：热打击前2 h自尾静脉注射GW4869(2 mg/kg)。对照组不进行热打击或外泌体输注，其他步骤相同。取以上5组小鼠血清，按试剂盒说明书检测ALT、AST和LDH水平。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以表示，两组比较用独立样本t检验；多组比较时，若方差齐使用One-way ANOVA检验，方差不齐用Welch法，进一步两两比较用post-hoc事后分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 肝细胞外泌体鉴定 外泌体呈双层膜状包裹的圆形或椭圆形结构，直径约100 nm(图1A)。NTA检测示肝细胞释放囊泡直径为90～150 nm，符合外泌体典型的直径分布特征(图1B)。Western blotting检测囊泡外泌体特征表面标志物显示外泌体高表达CD9、CD63和CD81(图1C)，表明分离的外泌体具有高纯度。中暑组肝细胞释放的外泌体数量明显高于对照组[(8.46±1.38)×109/mlvs.(0.66±0.16)×109/ml，t=5.605，P=0.005]。

2.2 中暑肝细胞外泌体体外及体内摄取实验PKH-67标记HepG2细胞外泌体加入受体HepG2细胞作用6 h后，共聚焦显微镜观察显示，受体肝细胞内出现明显PKH67绿色荧光，表明外泌体被受体肝细胞内化(图2A)。通过尾静脉内注射PKH-67染色中暑供体肝细胞外泌体注入C57BL6小鼠4 h，共聚焦显微镜可观察到肝脏对外泌体的吸收(图2B)。

图1 肝细胞外泌体特征鉴定Fig.1 Identification of hepatocyte exosomes characteristics

2.3 中暑肝细胞外泌体KEGG通路富集分析iTRAQ定量蛋白质谱分析结果显示，热打击明显改变了肝细胞外泌体蛋白的表达，表达上调前10位的蛋白质基因名见图3A。随后使用KEGG数据库对筛选出的蛋白质进行通路富集分析，结果显示中暑外泌体高表达通路包括坏死性凋亡途径、PI3K(磷脂酰肌醇3'-激酶)-Akt信号传导途径、抗原加工和呈递途径、凋亡途径及NOD样受体信号通路(图3B)。

图2 共聚焦显微镜观察中暑肝细胞外泌体的体内及体外摄取Fig.2 Uptake in vivo and in vitro of exosomes in heatstroke hepatocyte (confocal microscopy)

图3 中暑肝细胞外泌体KEGG通路富集分析Fig.3 Enrichment analysis of KEGG pathway of exosomes in heatstroke hepatocyte

2.4 外泌体刺激受体肝细胞实验 体外刺激实验中，与对照组比较，热打击刺激组、热打击组肝细胞上清ALT、AST、LDH水平均明显升高(P＜0.05)，而正常刺激组则无明显变化。热打击预处理组的上述指标明显低于热打击组，差异有统计学意义(P＜0.05，表1)。

2.5 外泌体体内回输刺激实验 与对照组比较，热打击输注组和热打击组小鼠血清ALT、AST、LDH水平明显升高(P＜0.05)，而正常输注组无明显变化。热打击预处理组上述指标水平明显低于热打击组，差异有统计学意义(P＜0.05，表2)。

表1 各组小鼠肝细胞上清ALT、AST、LDH水平比较(U/L，，n=3)Tab.1 Comparison of ALT, AST, LDH levels in supernatants of hepatocyte in each group (U/L, , n=3)

表1 各组小鼠肝细胞上清ALT、AST、LDH水平比较(U/L，，n=3)Tab.1 Comparison of ALT, AST, LDH levels in supernatants of hepatocyte in each group (U/L, , n=3)

ALT.谷丙转氨酶；AST.谷草转氨酶；LDH.乳酸脱氢酶；与对照组比较，(1)P＜0.05；与热打击刺激组比较，(2)P＜0.05；与热打击组比较，(3)P＜0.05。

组别 ALT AST LDH对照组 14.31±2.57 13.39±3.02 14.75±3.16正常刺激组 24.61±10.62 26.61±12.91 20.15±7.81热打击刺激组 126.90±15.26(1) 114.61±12.38(1) 110.00±17.37(1)热打击组 109.91±10.39(1) 136.90±19.47(1) 103.51±26.43(1)热打击预处理组 53.34±12.38(2)(3) 57.41±2.54(2)(3) 49.05±15.95(2)(3)

表2 各组小鼠血清ALT、AST、LDH水平比较(U/L，，n=6)Tab.2 Comparison of serum ALT, AST, LDH levels in each group of mice (U/L, , n=6)

表2 各组小鼠血清ALT、AST、LDH水平比较(U/L，，n=6)Tab.2 Comparison of serum ALT, AST, LDH levels in each group of mice (U/L, , n=6)

ALT.谷丙转氨酶；AST.谷草转氨酶；LDH.乳酸脱氢酶；与对照组比较，(1)P＜0.001；与热打击输注组比较，(2)P＜0.001；与热打击组比较，(3)P＜0.001。

组别 ALT AST LDH对照组 27.37±9.74 25.47±5.09 29.31±5.56正常输注组 27.71±1.94 24.47±3.91 29.64±4.49热打击输注组 89.61±10.56(1) 92.63±4.97(1) 91.00±8.03(1)热打击组 106.30±6.11(1) 99.31±9.47(1) 97.67±3.78(1)热打击预处理组 53.46±11.04(2)(3) 57.71±4.99(2)(3) 57.97±4.70(2)(3)

3 讨 论

外泌体是近年来新发现的一种细胞间通讯方式，可在相邻或远处细胞之间运输各种信号分子，从而参与下游靶细胞的功能调节及各种生理病理过程。几乎所有细胞都可以分泌外泌体，且外泌体几乎存在于所有人体体液中，包括血液、胆汁、腹水、唾液、乳汁、脑脊液、尿液、羊水和精液。如何分离到高纯度的外泌体是一项重大挑战。超高速梯度离心法被认为是最经典的外泌体分离方法[16]，可以获得高纯度的外泌体。本研究通过对肝细胞进行43 ℃热打击后降温9 h，随后超高速梯度离心上清提取沉淀，通过形态学、直径分布及特征性表面标记物对外泌体进行鉴定。结果在透射电镜下观察到的囊泡形态符合典型的外泌体特征：单个分布，呈圆形或椭圆形，可见明显的膜性结构；但仍需进一步与其他外形相似的细胞外囊泡进行鉴别。外泌体是来源于内体的囊泡，其大小是由电镜下观察到的多泡小体(MVB)中的囊泡(ILV)大小来界定的，也是其与其他类型细胞外囊泡(EV)的重要区别。由于电镜测算ILV的直径为30～100 nm，也可能略大一些，可达到150 nm，因此认为外泌体的直径范围也在此区间。而EV是由细胞膜直接向外出芽产生的，或者是细胞死亡后释放的凋亡小体，其大小范围不受限制，异质性较强，可大至数微米，或者比外泌体更小。本研究经过纳米追踪技术测定的囊泡直径分布绝大部分在30～150 nm的区间，在外泌体典型直径范围内。但仍有部分其他类型的胞外囊泡大小与外泌体相近，另外也有相似大小的蛋白质杂质，这些都不能很好地区分。生物化学上，外泌体含有常见的“标记蛋白”(如内体特异性四跨膜蛋白：CD9、CD10、CD26、CD53、CD63、CD81、CD82；参与MVB生物发生的内体相关蛋白：Alix和Tsg101等)，但不表达细胞核、线粒体、内质网和高尔基体相关的蛋白。本研究通过Western blotting方法检测分离的分泌物中上述特征性标记蛋白的表达，发现外泌体高表达CD9、CD63及CD81，说明中暑能诱导肝细胞释放外泌体，且经过经典的超高速梯度离心法分离到的肝细胞外泌体具有较高的纯度。这是下一步研究能够进行的先决条件。虽然笔者选择了常用的外泌体标记物进行鉴定，但目前关于标记物的选择仍没有固定的金标准，原因在于外泌体形成过程中其膜结构的多样性，以及与其他类型囊泡的结构相似性[17]。更精确的生物标记物仍有待进一步研究。

外泌体在不同的应激条件下，可主动选择富集其内含物，发挥不同的生物学功能。因此分析它们的蛋白质或RNA内含物的表达差异可以提供外泌体与疾病相关性的信息，并筛选用于诊断和预后预测的新型生物标志物。在肝脏疾病中，全面蛋白质组学分析和miRNA测序均显示药物诱导的肝损伤(DILI)和酒精性肝炎中血清外泌体蛋白/miRNA的表达谱发生改变[18-20]。在非酒精性肝炎中，也揭示了外泌体中高表达的蛋白质与其病理机制之间的联系，并筛选出候选蛋白/miRNA作为预测器官损伤的新型标记物[20]。肝细胞是肝脏中主要的实质和功能细胞以及主要的外泌体分泌细胞，且肝细胞不仅是热损伤的主要靶细胞，更能积极主动参与诱导进一步损伤。研究中暑肝细胞衍生的外泌体如何介导肝细胞之间的通讯及在肝损伤中的作用可以提供对中暑肝损伤发病机制的新理解。

中暑肝损伤的机制目前尚不清楚，动物中暑模型和临床中暑患者肝脏的病理变化主要表现为大量中性粒细胞浸润，肝窦内皮细胞剥脱，肝窦内局部微血栓形成，肝细胞变性或气球样变或绒毛扁平，肝细胞膜破裂等，这种病理改变以肝窦周边肝细胞最为明显，提示一方面高热可能对肝细胞造成直接损伤，另一方面肝细胞损伤后启动的多种继发性损害因素如失衡的炎症反应对肝细胞的再次损伤可能更为重要。本研究通过KEGG分析发现，中暑刺激下肝细胞释放的外泌体中的蛋白质参与各种细胞死亡、炎症信号通路的激活，如NOD样受体信号通路，坏死性凋亡(一种炎症性死亡模式)，抗原提呈与加工等。同时证明了中暑肝细胞外泌体通过被受体肝细胞或体内肝脏摄取，在体外和体内均能诱导肝损伤，初步表明中暑肝细胞释放的外泌体可能通过激活受体细胞上述通路在诱导肝脏炎症损伤过程中发挥作用。

本研究尚有不足之处：热打击肝细胞外泌体高表达多种参与炎症信号的通路及相关蛋白质，本研究没有进一步直接研究其促进中暑肝损伤的具体机制。除蛋白质外，外泌体还含有其他成分，如核酸、脂质，这些物质也影响外泌体和靶细胞的生物学功能，值得进一步研究。

综上所述，本研究初步证实了热打击诱导下肝细胞释放的外泌体参与了中暑急性肝损伤过程，经超高速梯度离心法分离获得的热打击肝细胞外泌体纯度较高；热打击肝细胞外泌体在体外可被受体肝细胞内吞，在体内也可被肝脏摄取，外泌体富集参与炎症损伤的信号通路的蛋白质，在体内外均可诱导肝损伤。