基于多指标综合评分法优化黄连工业化生产提取工艺△

谭雨晴，何轩辉，马涛，宋旭东，陈恒文 *

1.中国中医科学院 广安门医院，北京 100053；2.北京中医药大学，北京 100029； 3.宁夏回族自治区第五人民医院，宁夏 石嘴山 753000

黄连性寒，味苦，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿，泻火解毒等功效，药用始载于《神农本草经》[1]，为中医临床常用中药。黄连为毛莨科植物黄连CoptischinensisFranch.、三角叶黄连CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao和云连CoptisteetaWall.的干燥根茎[2]，分别习称味连、雅连、云连。《本草纲目》云：“其根连珠而色黄，故名”，主要分布在川、渝、滇、贵、藏等地[3]。

现代化学成分研究表明，黄连的有效成分主要为以盐酸盐形式存在的小檗碱，质量分数达5%～8%。此外还含有黄连碱、巴马亭、药根碱、甲基黄连碱、木兰花碱、表小檗碱等生物碱类成分[4-9]。在现代药理学研究中，最初发现小檗碱等生物碱类成分具有抗菌、抗病毒功效，传统上一直作为清热解毒和抗感染药物，由此研发的黄连素主要用于治疗肠道细菌感染性疾病[10]。近年来，随着临床药理学的不断深入研究，陆续发现黄连还有改善充血性心力衰竭、扩张冠状动脉、抗心律失常、降血糖、降血脂、抗血小板凝集、抗炎、抗肿瘤等药理作用[11-13]。因此，小檗碱等黄连生物碱的提取对于临床治疗有着重要的意义。

随着中药提取纯化工业科技的发展，近年报道了很多黄连的新提取方法，如超声提取、微波提取、酶法提取技术等[14-17]，与传统酸水法、石灰乳法、醇提法、索氏提取法等相比较，在一定程度上提高了有效成分的溶出速度和溶出量，还避免了高温加热对有效成分的破坏，但很多工艺还远没有达到工业化的要求，而且会带来噪声、污染等环保问题，增加企业的成本，极大地限制了新技术的应用。从目前的企业生产工艺来看，多数中药企业对含有黄连的中药复方制剂依然采用水提、醇提等传统工艺方法，通过对黄连提取工艺的优化，并与其他中药提取物混合，可以达到中药复方的质量要求。本实验结合生产实际，通过单因素试验，进而优化盐酸小檗碱等4种黄连生物碱的提取工艺，并经过工业化生产的验证进一步优化提取浓缩干燥的工艺参数，为黄连及其复方中药制剂的工业化提取及中药提取由实验室向生产转化提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1200 HPLC高效液相色谱色谱仪；BSA124S电子分析天平(德国Sartorius公司，精度0.1 mg)；IKA RV10旋转浓缩蒸发仪(德国IKA公司)；SHB-Ш型台式循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DZF-6050AB真空干燥箱(上海科晓科学仪器有限公司)；GL-20G-Ⅱ冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；SXKW-500智能控温电热套、DZKW-4 电热数显恒温水浴锅、101-0AB电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；MG6真空干燥机、RTN3000/1000热回流提取浓缩机组、WZ1000单效外循环真空浓缩器(常州德尔松压力容器有限公司)。

1.2 试药

实验中所用中药饮片黄连由北京丰泰金源药业有限公司提供，取自中国中医科学院广安门医院药房，产地重庆，批号：20140505，经中国中医科学院广安门医院王丽霞主任药师鉴定符合《中华人民共和国药典》2015版一部药用标准。

盐酸小檗碱对照品(批号：110713-201212，纯度：96.7%)购于中国食品药品检定研究院；95%乙醇(北京鸿志伟达工贸有限公司)；甲醇、乙腈(美国Fisher 公司，色谱纯)；无水乙醇、磷酸二氢钾等皆为分析纯。

2 方法

2.1 黄连生物碱测定方法

色谱条件：安捷伦TC C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；以乙腈-0.025 mol·L-1磷酸二氢钾溶液(27∶73)为流动相；检测波长为345 nm；流速为1.0 mL·min-1；进样量为10 μL。

对照品溶液的制备：按照2015版《中华人民共和国药典》黄连项下规定[2]，精密称定盐酸小檗碱对照品适量，加入甲醇制成每1 mL含0.090 5 mg的溶液。分别取0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL稀释至10 mL，配制不同浓度的对照品溶液，备用。

计算含量时，以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照，分别计算小檗碱、表小檗碱、黄连碱和巴马汀的含量，以盐酸小檗碱色谱峰的相对保留时间为标准，表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的峰保留时间应在规定值的±5%范围之内，即得。

标准曲线的绘制：将配制好的不同浓度的对照品溶液分别进样，以溶液浓度为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，每个样品平行测定2次，绘制标准曲线。

精密度的测定：取质量浓度为0.090 5 mg·mL-1的盐酸小檗碱对照品溶液，平行测定5次，计算峰面积及RSD。

加样回收率的测定：精密量取已测含量的黄连提取液9份，每份5 mL，分别加入0.090 5 mg·mL-1盐酸小檗碱对照品溶液，第1～3份精密加入1 mL，第4～6份加入2 mL，第7～9份加入3 mL，每个样品平行测定2次，计算回收率及RSD。

2.2 黄连醇提与水提比较分析

称取黄连饮片50 g加8倍量的水或醇回流提取1.0 h，提取 3次，提取液不合并，分别稀释25倍，过滤，分别测定。

2.3 乙醇提取单因素考察分析

乙醇浓度考察分析：取50 g黄连饮片分别加入8倍量30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇，加热回流提取1 h，提取2次，合并提取液，过滤，定容，测定黄连生物碱含量，每个样品重复3次。

料液比考察分析：取50 g黄连饮片分别加入2、4、6、8、10、12倍量60%乙醇，加热回流提取1 h，提取2次，合并提取液，过滤，定容，测定黄连生物碱含量，每个样品重复3次。

提取时间考察分析：取50 g黄连饮片分别加入8倍量60%乙醇，分别加热回流提取0.5、1.0、1.5、2、2.5 h，提取2次，合并提取液，过滤，定容，测定黄连生物碱含量，每个样品重复3次。

为了确定乙醇提取的最佳工艺条件，笔者拟以L9(34)进行正交试验，从而确定最优工艺，因素水平见表1。

表1 黄连乙醇提取的因素水平

2.4 乙醇提取工艺验证

为了进一步验证所选最优工艺，取150 kg黄连饮片按照优化的工艺进行提取，共3批重复，过滤，定容，测定提取液中黄连生物碱含量和干膏得率。

2.5 真空干燥工艺的优化

提取液采用减压浓缩，减压浓缩温度为60 ℃，分别浓缩至密度为1.12、1.18、1.24，进行真空干燥工艺的优化。采用L9(34)进行正交试验，确定最优干燥工艺，主要考察干燥温度、浓缩液密度、浓缩液厚度对黄连生物碱的影响，正交试验设计见表2。

表2 黄连乙醇提取液的真空干燥因素水平

2.6 真空干燥工艺的验证

为了进一步验证真空干燥的最优工艺条件，取3批相同样品，每批取10 L密度为1.18的浓缩液，平铺于真空干燥盘中，铺设浓缩液厚度为2 mm，控制真空干燥温度为60 ℃，进行减压干燥，干燥后测定黄连生物碱的含量。

2.7 干膏含量的测定

黄连经工业化乙醇提取、减压浓缩、真空干燥后，测定其干膏率、黄连生物碱含量及转移率，验证工艺的合理性。

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制及方法学考察

本实验按照《中华人民共和国药典》标准，采用HPLC测定盐酸小檗碱等黄连生物碱，其盐酸小檗碱的HPLC图和黄连提取液中黄连生物碱的HPLC图见图1～2，用待测成分色谱峰与盐酸小檗碱色谱峰的相对保留时间的比值确定各成分的具体峰位。表小檗碱(0.73)、黄连碱(0.79)、巴马汀(0.91)、小檗碱(1.000)相对保留时间在规定值的±5%范围之内，符合《中华人民共和国药典》黄连项下规定[2]。以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照，分别计算表小檗碱、黄连碱、巴马汀和小檗碱的含量。HPLC测定盐酸小檗碱的标准曲线为Y=45 834X+145.91，r=0.999 9，线性范围0.45～90.50 μg·mL。精密度测定结果显示精密度良好,RSD为0.14%，加样回收率结果显示回收率为99.5%～101.6%，且RSD为0.71%，显示回收率良好，方法准确可行。

3.2 黄连醇提与水提比较分析

黄连药材中4种生物碱质量分数为11.47%，通过对黄连乙醇提取和水提取的比较分析，发现黄连中4种生物碱在60%乙醇中的总提取率为85.34%，高于水的提取率(74.36%)，4种生物碱的提取率均高于水的提取率，且提取2次即可达到提取的效果，结果见表3。

图1 盐酸小檗碱对照品HPLC图

图2 黄连提取液中黄连生物碱的HPLC图

表3 黄连生物碱醇提和水提比较分析

提取溶剂提取次数/次有效成分质量分数/%表小檗碱黄连碱巴马汀小檗碱总生物碱提取率/%60%乙醇11.121.180.993.827.1161.9820.310.380.291.032.0117.5230.090.150.090.340.675.84合计1.521.711.375.199.7985.34水10.680.680.622.234.2142.0220.310.380.291.402.3823.7630.100.140.110.510.868.58合计1.091.201.024.147.4574.36

注：有效成分质量分数为有效成分质量/药材质量×100%，药材中4种黄连生物碱质量分数为11.47%。

3.3 乙醇提取单因素结果

通过对黄连进行乙醇提取工艺中乙醇浓度、加醇量、提取时间等单因素的考察，发现乙醇浓度在50%、60%、70%时黄连生物碱提取率较高，超过70%提取率有所降低(见图3)；对料液比的考察中发现随着加醇量的增加，黄连生物碱的含量逐渐增高，当加醇量超过6倍时，黄连生物碱提取量不再明显增加，保持稳定(见图4)；对提取时间考察发现，随着时间的延长黄连生物碱提取量显著增加，超过1.0 h后增加不显著，当提取时间超过2.0 h，随着乙醇的蒸发及提取时间的延长，黄连生物碱受到破坏，含量反而有所降低(见图5)。因此后续正交试验设计中，加入乙醇的浓度选择50%、60%、70% 3个水平，料液比选择6倍、8倍、10倍3个水平，提取时间选择1.0、1.5、2.0 h 3个水平。

图3 乙醇浓度对黄连生物碱提取的影响

图4 料液比对黄连生物碱提取的影响

图5 提取时间对黄连生物碱提取的影响

3.4 乙醇提取工艺条件的优化

对黄连进行乙醇提取，参考本课题组前期多指标综合评分法优化提取中药复方工艺的方法[17-18]，赋予提取指标比重为：干膏率50%、黄连生物碱质量分数50%，计算综合得分。结果分析见表4～6。

表4 黄连L9(34)乙醇提取正交试验设计与结果分析

表5 黄连乙醇提取工艺参数均值响应

注：Delta为每个因子的最大平均响应值和最小平均响应值之差。

表6 黄连乙醇提取工艺参数方差分析

注：SeqSS为连续平方和；AdjSS为校正平方和；AdjMS为校正均方。下同。

由正交试验结果可以得出，黄连乙醇提取的最佳工艺条件为A3B2C2，即加入8倍70%乙醇，提取1.5 h，提取2次。提取时间影响差异有统计学意义(P<0.05)，乙醇浓度、料液比影响差异无统计学意义(P>0.05)。根据实际生产情况、节省能源及正交试验方差结果分析，最佳工艺条件调整为：加入8倍60%乙醇，提取1.5 h，提取2次。

按最优工艺参数提取3批样品，每批5000 g，加入8倍60%乙醇，提取1.5 h，提取2次，过滤，定容，分别计算干膏率和黄连生物碱的含量，并计算综合得分，为98.37、99.05、98.55，平均得分为98.66，RSD为0.36%，因此确定的黄连乙醇提取工艺参数可行。

3.5 真空干燥工艺的优化

黄连提取过程中发现，干燥工艺对干膏量的影响不大，但对于黄连生物碱含量影响较大，因此采用正交试验优化真空干燥条件对黄连生物碱的影响，包括干燥温度、浓缩液密度、料液厚度，结果见表7～9。由正交试验结果可以得出，真空干燥最佳工艺条件为A3B3C1，即温度70 ℃，浓缩液密度为1.24，物料铺设厚度为1 mm。影响真空干燥的显著因素是浓缩液密度(P<0.01)、料液铺设厚度(P<0.05)，干燥温度影响差异无统计学意义(P>0.05)。根据实际生产情况，从对黄连生物碱的破坏、节省能源的角度考虑，结合正交工艺方差分析结果，干燥温度调整为60 ℃，浓缩液密度调整为1.18，料液铺设厚度为2 mm。按最优真空干燥工艺验证该工艺对黄连生物碱的影响，即温度60 ℃，浓缩液密度为1.18，物料铺设厚度为2 mm，所得3批样品黄连生物碱的质量分数分别为8.99%、9.10%、8.95%，平均质量分数为9.01%，RSD为0.86%，因此该工艺可行。

表7 黄连L9(34)真空干燥正交试验设计与结果分析

注：黄连生物碱质量分数为4种黄连生物碱质量/药材质量×100%。

表8 黄连真空干燥工艺参数均值响应

注：Delta为每个因子的最大平均响应值和最小平均响应值之差。

表9 黄连真空干燥工艺参数方差分析

3.6 干膏率及有效成分测定

采用最优提取、浓缩、干燥工艺进行大生产后，对所得的干燥提取物进行干膏率、黄连生物碱及转移率的测定，结果见表10。由结果可以看出，优化工艺生产的提取物干膏量及有效成分转移率均较高[19-21]，有效成分损失较少，达到生产的要求。

表10 黄连提取物干膏率及有效成分的测定 /%

注：黄连生物碱质量分数为4种黄连生物碱质量/干膏质量×100%；提取率为干膏中4种黄连生物碱质量/药材中的4种黄连生物碱质量×100%。

4 讨论

黄连生物碱作为黄连的主要有效成分，由于水溶性较低，其提取、浓缩、干燥工艺一直是生产的重点和难点，作为生产企业希望能摸索出具有简单、安全、成本低、提取率高等优势的适合工业化生产的工艺，虽然目前有一些黄连超声提取、微波提取、酶法提取技术的报道，但对含有黄连中药制剂的工业化提取还不成熟，因此本实验通过实验室工艺摸索与工业生产相结合，确定了黄连及其中药复方乙醇提取的工艺，具有切实的可行性。

整个实验过程中采用饮片投料，避免提取过程中粉碎太细造成的糊底、过滤难、增加繁琐的工作量等难题，更符合实际的工业化生产；提取过程中，第一次提取时加入乙醇后应浸泡0.5 h，让饮片充分浸润再进行提取，可以使有效成分提取更完全；在浓缩过程中，当乙醇蒸发后，黄连生物碱会大量析出，此时应将沉淀物过滤后再进行浓缩，以免时间过长破坏黄连生物碱的成分，同时避免结块现象的发生；在工业化生产中如有块状物出现，应检测分析是否是黄连生物碱，切不可随意丢弃；真空干燥时应避免浓缩物铺设过厚，以2 mm为宜，干燥温度控制在60 ℃，此条件下干燥时间不会超过12 h，对黄连生物碱损失较小。

黄连经过乙醇提取浓缩、真空干燥工艺优化后，黄连生物碱转移率可达到85%，完全达到工业化生产的要求，为黄连及其中药制剂的工业化提取提供实验依据。