基于UPLC-MS/MS对木蝴蝶配方颗粒6种成分含量测定及特征图谱研究△

何民友，魏梅，程学仁，王利伟，吴淑珍，索彩仙，李国卫

广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244

木蝴蝶为紫葳科木蝴蝶属木蝴蝶Oroxylumindicum(L) Vent.的干燥成熟种子[1]。木蝴蝶始载于《滇南本草》，原名千张纸，《本草纲目拾遗》始名木蝴蝶[2]。其味苦、甘，凉，入肺、肝、胃经，有清肺利咽、疏肝和胃之功效。已有的文献报道[3]中指出，在木蝴蝶成熟种子中含有大量具有生物活性的黄酮类化合物，如黄芩苷、黄芩苷元、白杨黄素、槲皮素等。现代药理医学研究表明，木蝴蝶具有抗炎、抗氧化、抗癌、降糖、抑制病毒及肿瘤生长等多种药理作用[4-9]。具有药理活性化学成分脂肪油、黄芩苷元-7-葡萄糖苷、黄芩苷、黄芩苷元、千层纸素A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素-7-葡萄糖醛酸苷等黄酮类化合物[10]。

木蝴蝶配方颗粒是木蝴蝶饮片经水提取后制粒而成，供临床调配组成复方汤剂使用，具有免煎易服、水冲即溶、携带方便、剂量准确等特点。目前国内外关于木蝴蝶配方颗粒的化学成分和药理的文献较少，且还没有建立利用某些特征性的化学成分对木蝴蝶配方颗粒进行客观评价和质量控制的方法。通过文献研究[11-13]发现，关于木蝴蝶黄酮类成分含量测定的报道多以槲皮素、木蝴蝶苷B、黄芩苷和黄芩素等成分测定为主，因各化学成分最大吸收波长不一，要实现一法测定多指标成分含量需通过全时段多波长融合来实现[14]。黄酮类化合物在植物体内大部分与不同的糖结合成苷，其结构复杂多样，不易测定。常用黄酮类物质测定方法有分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法。分光光度法测定由于杂质干扰严重，导致准确性差，难重现；高效液相色谱法对分离度要求高[15]。基于此，本实验在参考文献[16-17]的基础上，建立高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS)同时测定该类物质的方法，能有效快速测定木蝴蝶配方颗粒中6种黄酮类化学成分的含量；同时，本实验还建立木蝴蝶配方颗粒特征图谱，为中药木蝴蝶的多指标质量控制和较全面质量评价奠定基础。

UPLC-MS是目前广泛应用的分析方法之一。它利用液相色谱的高效分离能力对分析物进行分离，再以质谱为检测器使待测化合物产生气态离子，再按m/z将离子分离，检测。UPLC-UV-MS能充分发挥色谱的分离能力，并具有质谱的高分辨特性，可得到保留时间、紫外响应、荷质比响应这样的三维信息，适合分析中药多组分复杂体系。本实验选取木蝴蝶配方颗粒中黄酮类指标性的代表成分白杨素、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B 6种成分，以超高效液相-串联质谱(UPLC-MS/MS)为监测平台，利用多反应选择性检测(MRM)的方法进行检测，该方法快速、准确、抗干扰力强，建立快速可靠的定量检测方法，通过特征图谱为全面有效控制木蝴蝶配方颗粒的质量提供技术支撑。

1 材料

1.1 仪器

Waters 液质联用仪(液相部分ACQUITY UPLC H-Class、质谱部分Waters Xevo TQD MS)；百万分之一天平(METTLER TOLEDO，XP26)；万分之一天平(METTLER TOLEDO，ME204E)；电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司，HWS-28)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，KQ500DE)；超纯水系统(默克股份有限公司，Milli-Q-Direct)。

1.2 试药

白杨素对照品(批号：111701-200501，纯度：100%)、木蝴蝶苷B对照品(批号：111915-201603，纯度：91.9%)、黄芩苷对照品(批号：110715-201720，纯度：93.5%)、黄芩素对照品(批号：111595-201607，纯度：98.5%)购自中国食品药品检定研究院；白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品(批号：wkq17072702，纯度：98%)购自四川省维克奇生物科技有限公司；木蝴蝶苷A对照品(批号：17021703，纯度：98%)购自成都普菲德生物技术有限公司；乙腈(德国merck公司，色谱纯)；乙醇、甲醇(西陇科学股份有限公司，分析纯)；磷酸、甲酸(天津科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)；水为实验室自制水。

16批木蝴蝶配方颗粒由广东一方制药有限公司生产，均来自供应商，经广东一方制药有限公司质量部检测均符合2015年版《中华人民共和国药典》木蝴蝶项下要求。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，梯度洗脱(0～10 min，10%～13%A；10～20 min，13%～20%A；20～28 min，20%～35%A；28～33 min，35%～65%A；33～40 min，65%A)；流速为0.28 mL·min-1；柱温为30 ℃；进样体积为1 μL；检测波长为276 nm。

2.2 质谱条件

色谱柱：Agilent SB C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；以乙腈为流动相A，以0.01%甲酸为流动相B，梯度洗脱(0～10 min，10%～13%A；10～20 min，13%～20%A；20～28 min，20%～35%A；28～33 min，35%～65%A；33～40 min，65%A)；柱温为30 ℃；流速为0.28 mL·min-1；检测波长为276 nm。

电喷雾离子源(ESI+)，喷雾电压为1.55 kV；脱溶剂温度为597 ℃，离子源温度为148 ℃；脱溶剂气流为997 L·hr-1；氮气流为1 L·hr-1。质谱扫描采用多反应检测(MRM)扫描模式。Cone参数和Collision质谱参数优化通过蠕动针泵注射的方法调谐各标准化合物。所得参数见表1，最终得到的液相紫外图谱和质谱提取离子流图分别见图1～2。

表1 LC-MS检测木蝴蝶配方颗粒标准化合物的质谱参数

注：*定量离子。

注：A.对照品；B.木蝴蝶配方颗粒。图1 对照品和木蝴蝶配方颗粒色谱图

注：A.木蝴蝶苷B；B.黄芩苷；C.木蝴蝶苷A；D.白杨素-7-O-β-D葡萄糖醛酸苷；E.黄芩素；F.白杨素。图2 木蝴蝶配方颗粒供试品总离子流图

2.3 混合对照品溶液的制备

分别精密称取白杨素、黄芩素、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黄芩苷和木蝴蝶苷B对照品适量，加甲醇溶解定容至25 mL，即得白杨素、黄芩素、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黄芩苷、木蝴蝶苷B质量浓度分别为12.594、69.600、32.286、128.256、31.512、60.276 μg·mL-1的混合对照品储备液，于4 ℃保存，备用。

2.4 供试品溶液制备

取木蝴蝶配方颗粒适量，研细，取约0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定质量，超声处理(功率：300 W，频率：40 kHz)30 min，取出，放冷，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm滤膜滤过，即得。

3 含量测定结果

3.1 方法学考察

3.1.1精密度试验 精密吸取混合对照品溶液5.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成含白杨素、黄芩素、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黄芩苷、木蝴蝶苷B质量浓度分别为6.297、34.800、16.143、64.128、15.756、30.138 μg·mL-1的对照品溶液，上述色谱条件下连续进样6次，考察精密度，峰面积RSD见表2，结果RSD<3%，表明仪器精密度良好。

3.1.2线性关系 精密量取混合对照品溶液，按稀释倍数为1、1.2、1.5、2、3、6依次逐级稀释，定容，制得6个浓度梯度的系列混合对照品溶液，按照2.2中的质谱条件测定，以峰面积对进样量浓度进行线性回归，绘制标准曲线，求得各成分回归方程、r、线性范围，见表3，结果显示6个成分的线性关系良好。

3.1.3重复性试验 取同一批木蝴蝶配方颗粒(批号：8016072)，按照供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，按照上述色谱和质谱条件进行平行测定，测得白杨素、黄芩素、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黄芩苷和木蝴蝶苷B的含量及相应的RSD，见表2，实验结果显示本方法重复性良好。

3.1.4稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h后进样，测定峰面积，峰面积RSD见表2，实验结果显示供试品溶液在12 h内稳定性良好。

3.1.5加样回收率 精密称取已知含量的木蝴蝶配方颗粒(批号：8016072)共6份，分别精密加入一定量的对照品溶液，按照2.4中供试品溶液的制备方法及2.2中的质谱条件测定，计算白杨素、黄芩素、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黄芩苷和木蝴蝶苷B的回收率，见表2，结果表明加样回收率良好。

3.1.6含量测定 按照2.4中供试品溶液的制备方法及2.2中的质谱条件测定，计算木蝴蝶配方颗粒中的白杨素、黄芩素、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黄芩苷和木蝴蝶苷B 6种成分的含量，结果见表4。

表2 木蝴蝶配方颗粒方法学考察结果汇总

表3 木蝴蝶配方颗粒中6个成分的线性关系考察结果

表4 16批木蝴蝶配方颗粒含量测定结果(n=2) mg·g-1

4 特征图谱测定结果

4.1 方法学考察

4.1.1精密度试验 取含量测定项下供试品溶液，进样6次，每次1 μL，比较不同色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD，分别为0.06%～0.09%、0.10%～0.37%。结果表明该方法精密度好，符合特征图谱检测要求。

4.1.2重复性试验 取同一批木蝴蝶配方颗粒(批号：8016072)，按照供试品制备方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，进样量为1 μL，比较不同色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD，分别为0.08%～0.10%、0.03%～1.99%。结果表明该方法重复性好，符合特征图谱检测要求。

4.1.3稳定性试验 取含量测定项下供试品溶液，分别在0、2、4、8、10、12 h进样，每次进样1 μL，比较不同色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD，分别为0.10%～0.16%、0.04%～1.32%。结果表明该方法稳定性好，符合特征图谱检测要求。

4.1.4特征图谱峰指认 精密吸取白杨素、黄芩素、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木蝴蝶苷A、黄芩苷、木蝴蝶苷B混合对照品溶液，上述色谱条件下进样，得木蝴蝶配方颗粒对照图谱，见图3。

4.1.5特征图谱建立与特征峰 取16批木蝴蝶配方颗粒样品，按照2.4项下的方法制备供试品溶液，进样1 μL，测定得色谱图(见图4)。将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行数据处理，设定S1为参照图谱，与其他样品的色谱图自动匹配，生成木蝴蝶配方颗粒特征图谱(见图5)。分别计算16批木蝴蝶配方颗粒样品的相似度，见表5，16批木蝴蝶配方颗粒相似度均大于0.90，说明木蝴蝶配方颗粒化学成分一致性较好，质量比较稳定。

图3 木蝴蝶配方颗粒UPLC对照图谱

图4 16批木蝴蝶配方颗粒UPLC特征图谱

注：1.木蝴蝶苷B；2.黄芩苷；3.木蝴蝶苷A；4.白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；5.黄芩素；6.白杨素。图5 木蝴蝶配方颗粒UPLC特征图谱共有模式图

表5 16批木蝴蝶配方颗粒相似度

序号相似度序号相似度10.99790.99920.998100.99930.999110.99940.998120.99850.998130.99360.999140.99970.998150.99981.000160.997

以1号峰为参照峰，标示出木蝴蝶配方颗粒超高效液相紫外色谱图中的6个共有峰，共有峰的峰面积之和>90%。计算各色谱峰与参照峰相对保留时间的RSD。结果表明，样品各色谱图共有峰的相对保留时间RSD均<3.0%；而相对峰面积的RSD相差较大，见表6～7。

表6 16批木蝴蝶特征图谱共有峰的相对保留时间

表7 16批木蝴蝶特征图谱共有峰的相对峰面积

5 讨论

文献分析研究显示[18]，木蝴蝶药材中主要含有的黄酮类成分有白杨素、木蝴蝶苷B、黄芩素、黄芩苷、木蝴蝶苷A、白杨素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷等黄酮类成分及多种黄酮苷元。本研究对木蝴蝶配方颗粒中黄酮类化学成分进行研究，根据精确相对分子质量、相关文献、对照品色谱保留时间及二级谱图，得到标准化合物的质谱参数，建立木蝴蝶配方颗粒中化学成分含量的快速检测方法，并建立木蝴蝶配方颗粒特征图谱；与木蝴蝶药材研究文献相比，所建立的方法能更多地检测木蝴蝶配方颗粒中的黄酮类指标，且快速有效检测化学成分含量，通过特征图谱能对性状完全改变后的木蝴蝶快速鉴别，为其质量评价方法和化学成分的深入研究提供依据。

实验中对色谱条件和质谱条件进行了优化，对不同提取溶剂、不同提取方式、不同提取时间及不同料液比进行考察，以色谱峰信息量最大化、提取效率最高、方法稳定作为指标，最终确定以70%乙醇作为提取溶剂，超声处理(功率：300 W，频率：40 kHz)30 min，0.1∶50料液比作为样品的制备方法；对色谱条件中的色谱柱进行考察，经比较发现，Agilent SB C18柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)柱分离效果最好，峰形更好；特征图谱研究过程采用二极管阵列检测器对样品进行全波长扫描，发现在276 nm处基线稳定，各峰峰面积较高，因此，检测波长定为276 nm；对流动相中水相进行考察，通过对比乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%乙酸、乙腈-%甲酸及不同酸浓度对各色谱峰的影响，结果使用乙腈-0.1%磷酸各色谱峰分离效果最好，因质谱不能使用有机盐流动相，改用0.01%甲酸为水相后各色谱峰分离效果一致，通过耐用性考察发现，柱温和流速微小的变动能满足系统适应性要求。

本实验建立了木蝴蝶配方颗粒UPLC特征图谱方法，确定并指认了6各特征峰，较为全面地反映木蝴蝶黄酮类成分的特点。本研究与目前研究文献相比[19-20]：同样的分析时间条件下各色谱峰分离效果较好，且峰数较多；同样的分离效果条件下，有分析时间较短的优点。目前暂没有对木蝴蝶配方颗粒特征图谱的研究，本研究为今后木蝴蝶配方颗粒的研究提供参考。

中药配方颗粒是在中医药理论指导下，采用符合炮制规范的饮片为原料，以水作为提取溶媒，经过提取、过滤、浓缩、干燥、制粒等现代化生产工艺制备得到的供临床配方使用的颗粒制剂。其作为传统饮片有效替代，供临床辨证论治、随证加减、配方使用，与传统中药饮片相比，中药配方颗粒既保留了原中药饮片的药性、药味和药效，又具有不需煎煮、疗效确切、安全方便等优点，是“源于饮片，高于饮片”的现代中药新型汤剂。早于1993年，在国家科委、国家中医药管理局的带领下正式开展中药饮片剂型的改革，开始中药配方颗粒的研发和试点生产。2001年国家药监局颁发国家药监注〔2001〕325号文：“中药配方颗粒管理暂行规定”，并先后发文批准了6家企业为中药配方颗粒试点生产单位。但目前暂未对配方颗粒质量标准起草说明，本研究通过对木蝴蝶配方颗粒的质量研究，为木蝴蝶配方颗粒后续研究提供技术支持。

本实验采用UPLC-MS/MS技术对木蝴蝶配方颗粒黄酮类6种主要化学成分进行了快速定性及定量分析，研究结果发现，各批次间含量有一定的差异，由于药材受到产地、采收期及储存条件等因素影响，同时，生产工艺控制点及控制量的差异，也会造成产品含量的差异，因此，应严格控制原药材的质量，按照工艺规定操作控制，确保产品质量的稳定可控，以保证药品安全、有效。