血清学鉴定与基因检测互补验证ABO 疑难血型的应用探讨

陈 萍，张水木，雷 航，王钰箐，陈 宇，王学锋，蔡晓红

[1.北京中医药大学厦门医院（厦门市中医院）输血科，福建 厦门 361009；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院临床输血科，上海 200025；3.上海市嘉定区妇幼保健院检验科，上海 201821]

临床实验室中ABO 血型正反定型不符的原因多样[1-3]，使血型鉴定及输注血液选择的难度增加，影响着临床输血安全。血清学检测可以全面了解ABO 抗原抗体存在情况，但对于检测中出现的正反定型不符的原因分析，血清学的方法往往存在局限性，易受多种因素影响，如疾病状态、近期输血史、缺乏家系无法分析遗传性等。在这些方面，基因检测可弥补血清学的不足，为血清学鉴定困难的标本提供新的检测手段。基因检测近年来越来越广泛地被应用于ABO 疑难血型的鉴定，尤其是一些已知的明确导致血型异常的等位基因，一旦检出，可100%确定血型。然而，目前国内真正开展H 基因和ABO 基因检测的输血科并不多见。为此，本研究对我院2018 年7 例ABO 正反定型不符的标本进行基因分析，以探讨血型基因检测结合血清学方法在ABO 疑难血型鉴定中的应用，旨在建立稳定可行的检测方法组合，提高血型鉴定准确性，指导临床供血的选择。

资料与方法

一、资料

收集我院2018 年度血型血清学检查发现的7 例血型正反定型不符的成人，均无血液系统疾病、骨髓移植或造血干细胞移植等治疗状态，取乙二胺四乙酸二钠抗凝血液标本、唾液标本进行检测。所有患者取样均获得知情同意。送患者血样至上海交通大学医学院附属瑞金医院输血科进行血型基因测序。例1 为28 岁男性，门诊体检者，病史不详；例2 为28 岁男性，门诊患者，病史不详；例3 为36 岁男性，慢性乙型病毒肝炎患者，无输血史；例4 为23 岁女性，于我院产科检查；例5 为32 岁女性，因阑尾炎收住入我院；例6为26 岁男性，肛脓肿患者；例7 为50 岁男性，面神经麻痹患者。

二、方法

1.仪器与试剂：本研究所用试剂如下。单克隆抗-A、抗-B 试剂、ABO 反定型标准红细胞、不规则抗体筛检细胞采用的抗-H、抗-A1 试剂购自上海血液生物医药有限责任公司；抗-B 试剂购自长春博德生物技术有限责任公司；抗-Lea、抗-Leb 购自法国DIACAST 公司。仪器及试剂盒包括全自动血型分析仪（奥森多公司，型号为AutoVueInnova）、血液基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工生物技术有限公司）、TaKaRa La Tap 酶（日本TaKaRa 公司）、DNA 琼脂糖凝胶纯化试剂盒（北京TianGen 公司）、pMD18-T 载体（日本TaKaRa 公司）、PCR 仪（美国ABI 公司）、DNA 测序仪（美国ABI 公司，型号为PRISM377）、离心机（日本久保田公司，型号为KA-2200）。

2.血清学试验：检测包括ABO 血型正反定型、抗体筛查试验、吸收放散试验、唾液ABH 血型物质鉴定、Lewis 血型鉴定及H 抗原鉴定，检测时均按相关试剂说明书和《全国临床检验操作规程》[4]进行操作。正反定型的微柱凝集法鉴定结果采用盐水试管法验证确认，不凝集结果经显微镜下观察验证。

3.DNA 抽提和PCR 扩增：取200 μL 白膜层血样，用外周血DNA 抽提试剂盒提取全基因组DNA，分别对ABO 基因1～7 外显子、FUT1 基因和FUT2 基因进行PCR 扩增。扩增体系中包含全基因组DNA、TaKaRa La Taq 酶，ABO 基因1～7 外显子引物序列参见文献[5]，引物扩增区域包含外显子区域和外显子内含子交接区域。FUT1 基因和FUT2基因引物序列参见文献[6]。反应步骤为，95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30 个循环；最后72 ℃延伸7 min。

4.PCR 产物直接测序及克隆后测序：PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳纯化扩增，ABO 基因第6、第7 外显子和FUT2 基因的PCR 纯化产物直接进行测序。ABO 基因第7 外显子扩增产物克隆到pMD18-T 载体，PCR 插入片段随后在ABI377 测序仪上进行序列分析，用Chromos 软件比对和分析测序结果。

结 果

在7 例ABO 正反定型不符的标本中，血清学检测有3 例为类孟买血型，唾液存在ABH 血型物质；Lewis 血型为Le（a-b+），证实为分泌型（见表1）；其中标本1、2 在37 ℃下及室温下未检出有活性的抗-H 或抗-HI 抗体，吸收放散试验因标本不足而未检出与血型物质相符的血型抗原；标本3 检出抗-HI 抗体，在37 ℃下及室温下均有活性。

有2 例血清学表现为B（A）型（见表1），在正定型凝集强度改变的同时，血清中存在针对弱抗原的抗体，红细胞与抗-A1 不凝集，与抗-H 凝集强度大于正常B 型细胞。

有2 例血清学表现为Bw 亚型（见表1），红细胞与2 种不同厂家的抗-B 单克隆试剂的凝集强度均为2+，无双群现象；与抗-H 反应均增强，未检出不规则抗-B 抗体。

6 例标本基因分型与血清学格局相符，其中3 例类孟买血型个体的FUT2 基因经DNA 测序为常见的类孟买等位基因，均为分泌型（Se）表型，与唾液血型物质以及Lewis 血型检测结果相符；另外3 例ABO 血型亚型检出相应的关键突变位点（见表2）。上述6 例基因检测的结果可以补充血型资料并帮助最终确认血型，突变类型见图1。标本7 测序未发现ABO 基因编码区和已知调控区位点突变。

表2 基因测序结果

图1 基因突变测序图谱

讨 论

一、ABO 正反定型不符现象分析

ABO 血型系统是临床输血中最重要的血型系统。临床基层实验室通常将血清学抗原抗体相互验证后仍难以明确判定ABO 血型的血型统称为疑难血型。造成疑难血型现象的原因有冷凝集素、ABO血型不合造血干细胞移植、ABO 亚型、抗原减弱或缺失、抗体减弱或缺失、恶性血液病、自身抗体、意外抗体，另外还有补体致敏、假凝集及直接抗体阳性等多种因素[1-3]，其中，ABO 亚型和类孟买血型是ABO 正反定型不符现象的常见原因之一。类孟买血型是H 基因突变的结果，因其上位效应影响ABO基因产物，造成了ABO 血型异常表现，可以算作广义上的ABO 亚型[8]。

二、血清学检测血型的局限性

血清学凝集试验是经典的血型检测方法，目前其在实验室中具有不可替代性。但由于血型抗原抗体效价在不同的生理病理时期可能存在动态变化，不同抗血清试剂的差异、不同的亚型关键核苷酸突变、不同的共表达等位基因以及不同操作人员对结果的判读误差等难以避免的主客观因素，影响血清学鉴定结果。

三、血型基因分型与血清学方法互补确认血型

血型基因分型从分子水平鉴定血型，克服了血清学方法的局限性，近年来被用于预测血型、筛选罕见和无效型血型个体、鉴定ABO 和Rh 等血型定型疑难样品[9]。本研究中，标本1～6 基因分析结果与血清学表现相符，标本1、2、3 的H 基因突变是中国人群中常见的突变类型[10-11]，c.881_882de1TT 和c.551_552delAG 两者均为移码突变，导致生成截断的无功能的FUT1 酶，因此可推测红细胞上H 抗原完全缺失，也无法形成红细胞上的A 或者B 抗原。而标本1、2、3 红细胞采用正定型检测无法检出A或B 抗原，吸收放散试验由于标本量不足，结果为阴性，但参照之前的文献报道，这2 种基因型对应的类孟买血型红细胞上经吸收放散试验可以检出相应的A 和B 抗原[12]，推测这可能是由于检出的这些A 和B 抗原是从血浆中吸附了H 物质后形成，或直接就是吸附自体血浆的A 或B 物质。标本4、5的BA.04 基因型在国内也有较多报道，2 例共表达基因均为O 基因，产生典型的B(A)血型血清学表现，即红细胞A 抗原表达弱，H 抗原水平高，血清中有抗-A，是中国人中最常见的一种ABO 亚型[13]。标本6 基因型为B303/O.01，但红细胞与2 种单克隆抗-B（试剂1 为上海血液生物医药有限责任公司，批号为20 171023；试剂2 为长春博德生物技术有限责任公司，批号为20170406）作用均未出现B3血型混合视野特征，又因缺乏人源试剂，血清学分型只能鉴定为Bw，无法验证为B3型。不排除用人源试剂检测会出现混合视野特征而确认为B3的可能；然而由于人源抗血清没有商品化试剂，国内多数实验室缺乏人源抗血清，在实验试剂缺乏情况下，无法准确进行血清学分类而将ABO 亚型直接判读为w 的做法在国际输血行业受到认可。ABO 亚型的基因型与血清型不存在绝对的互相对应关系，如崔文燕等[14]报道的1 例B305/O.01.02 等位基因425C→T 突变具有B3混合视野特征，李归冀等[15]报道的1 例B3.05/O.01 等位基因425T＞C 突变无特异性混合视野特征。关于相同等位基因对应不同血清学亚型的情况，研究推测是由于不同实验室使用不同的抗血清，或个体受到共表达的另外一个ABO 等位基因的影响有关[16]。

基因突变造成其编码的糖基转移酶结构和活性改变，导致血型抗原合成异常，客观解释了血型抗原抗体在质和量的差异性原因。标本7 血清分型为Bw，无引起抗原减弱的临床病因，其ABO 基因1～7 外显子测序为正常B.01/O.01.02，不能排除其他未知位点突变，并非所有的血清学亚型在基因水平均能检出突变[16]，显示目前基因分型鉴定亚型同样也有局限性。目前对ABO 血型异常的基因检测最为明确和集中的类型主要包括类孟买、B(A)和cisAB 血型，这些类型几乎都能检测到相应的突变位点[5，7，13，16-18]。遗憾的是，本例Bw 未能取得家系成员进行遗传关系的验证。

四、基因分型是血清学检测的有益补充

本研究中，基因检测对类孟买血型和包括B(A)亚型在内的部分ABO 亚型具有明确的鉴定意义，对临床安全输血有重要价值。临床上，选择ABO 基因同型红细胞输血与O 型洗涤红细胞输注效果无显著性差异[3]，提示基因配型可以作为输血配型的重要依据。对于血清学表型疑似ABO 亚型但未检测到ABO 基因突变的个体，并不能完全排除其为ABO 亚型的可能性，应进行家系调查分析，证实其是否存在可遗传的血型异常，避免漏检ABO 亚型。血清学方法简单易行、高效灵敏[19]，既是ABO 亚型的初筛试验，也是在亚型确诊和输血方案确定之后判断不同血型间输注相容性的验证试验。基因分型有助于进一步了解血型的形成机制，只要检出突变的血型等位基因就能准确定型，与血清学方法互补，可清晰判断个体存在的抗原抗体、临床意义及遗传特性之间的逻辑关联。厘清ABO 血型抗原表达的复杂性，在临床治疗中将其用于选择和验证安全相容的血液制品，可提供个体获益最大的输血方案。基因分型是血清学检测的有益补充,为临床安全输血提供更有力的保障。