稀释蝰蛇毒时间试验与混合试验在狼疮抗凝物检测中的相关性研究

术 超，管甲亮，李 喆，刘 禹，王学锋，武文漫

（1.上海交通大学医学院附属瑞金医院检验科，上海 200025；2.青岛大学附属医院急诊内科，山东 青岛 266071）

狼疮抗凝物是一种能直接与磷脂或其复合物相结合的异质性免疫球蛋白，是抗磷脂抗体的一种，可见于多种自身免疫性疾病[1]。狼疮抗凝物持续阳性的患者被认为有较高的血栓形成和复发风险。狼疮抗凝物的实验室检测包括筛查试验、混合试验、确证试验等，基于共同途径原理的稀释蝰蛇毒时间（diluted Russell viper venom time，dRVVT）法和基于内源途径及共同途径的活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）法是目前临床实验室最常采用的2 种检测方法[2]。同时，美国临床和实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）指出，当筛查结果不明确时，混合试验可以帮助鉴别诊断凝血因子缺陷及其抑制物的存在，可提高实验诊断的准确率[2-3]。本研究拟探索确证试验dRVVT 标准化比值与混合试验检测结果间的相关性及方法学特点。

资料与方法

一、资料

在2015 年9 月至2019 年9 月期间，收集在上海交通大学医学院附属瑞金医院连续就诊的31 例凝血功能异常（APTT 筛选试验结果大于正常参考上限38.7 s）、狼疮抗凝物筛查及确证试验阳性患者的临床资料。在31 例患者中，男性10 例，女性21 例；年龄为15～74 岁，中位年龄为53 岁，呈偏态分布。所有患者就诊时均无血栓及出血的临床表现，且在采血前2 周内未使用肝素、华法林、阿司匹林等抗凝药物。本研究经上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会审核批准。

二、方法

1.标本采集：用109 mmol/L 枸橼酸钠抗凝管（枸橼酸钠与血液比例为1∶9）采集外周静脉血2.7 mL，并充分混匀，标本应无溶血、凝固、乳糜等现象。行3 000 r/min 离心10 min 后，分离乏血小板血浆，样本采集后2 h 内完成测定。

2.狼疮抗凝物筛选试验：应用Sysmex CS 5100全自动凝血分析仪及其配套试剂，基于凝固法测得APTT（以低浓度磷脂为激活剂）作为狼疮抗凝物的筛选实验。如果APTT 明显延长（大于正常参考值上限38.7 s)，则根据CLSI 关于狼疮抗凝物的实验室检测指南进行狼疮抗凝物的确证试验。

3.狼疮抗凝物确证试验：采用ACL TOP-700（美国Werfen Instrumentation Laboratory 公司）全自动凝血分析仪及其配套试剂测得dRVVT 标准化比值，以该值的大小表示狼疮抗凝物的阳性程度[2]。以上试验均严格按照仪器和试剂的说明书进行操作。筛查及确证试验dRVVT 的公式及参考范围如下。dRVVT 筛选比值=患者dRVVT 筛选时间（s）/dRVVT 筛选正常均值（s）；dRVVT 确证比值=患者dRVVT 确证时间（s）/dRVVT 确证正常均值（s）；dRVVT 标准化比值=dRVVT 筛选比值/dRVVT 确证比值。筛选试验采用低磷脂浓度试剂，确证试验采用高磷脂浓度试剂，dRVVT 标准化比值的最佳临界值为1.2。

4.混合试验：当dRVVT 标准化比值大于1.2 时，高度提示狼疮抗凝物阳性，则进一步行混合试验，也被称为纠正试验。国际血栓与止血学会推荐检测病人血浆（病浆）、正常血浆、1∶1 混合血浆（正常人与病浆），使用结果的比值Rosner 指数（也称循环抗凝指数）来进行评价[2,4]。dRVVT 确证试验与混合试验均出现阳性结果时，可判定为狼疮抗凝物阳性。

混合试验的判断标准如下。Rosner 指数（R）=（1∶1 混合血浆APTT 秒数-正常人血浆APTT 秒数）/病浆APTT 秒数×100%；R1=（即刻1∶1 混合血浆APTT 秒数-正常人血浆APTT 秒数）/病浆APTT 秒数×100%；R2=（孵育2 h 后1∶1 混合血浆APTT 秒数-正常人血浆APTT 秒数）/病浆APTT 秒数×100%（正常人血浆指20 人份正常人血浆制备正常人混合血浆；R1、R2>11 为抑制剂型、R1、R2<11 为因子缺乏型）。

三、统计学处理

应用SPSS 26.0 软件、Excel 软件进行数据的统计学描述、正态性检验以及相关性分析（P<0.05 表示差异有统计学意义），应用Graphpad Prism 8.0 绘图软件绘制统计结果。非正态分布的计量资料以中位数及图形表示其分布及离散程度。

结 果

一、实验室检测结果

31 例患者的狼疮抗凝物筛选试验APTT 值为42.5～91.0 s，均值为57.8 s；确证试验dRVVT 标准化比值为1.3～3.22，均值为2.28。正常人血浆的APTT 值为25.0～27.7 s，均值为26.4 s；1∶1 混合血浆即刻APTT 值为29.5～69.3 s，均值为46.8 s；1∶1混合血浆2 h APTT 值为29.9～75.2 s，均值为49.34 s。Rosner 指数（即刻，R1）为7.30～50.52，均值为33.81；Rosner 指数（2 h，R2）为8.60～61.72，为均值33.21，其具体分布见图1。

二、检测结果的相关性分析

绘制31 例患者dRVVT 标准化比值分别与病浆APTT 值、R1、R2 间关系的散点图（见图2），可以看出dRVVT 标准化比值分别与病浆APTT 值、R1 及R2值之间存在正相关性。进一步应用Pearson 相关性分析，计算其各自相关系数，具体结果见表1。dRVVT 标准化比值与病浆APTT 值、R1 及R2 值间显著相关，相关系数r 值在0.54～0.62 之间，且P 值均小于0.05。

图1 混合试验4 种血浆APTT 值及Rosner指数R1、R2 的分布情况

表1 dRVVT 标准化比值与混合试验结果间的相关性分析

讨 论

一、狼疮抗凝物的病理机制

狼疮抗凝物由一组抗磷脂或抗磷脂结合蛋白的自身抗体所组成，与抗心磷脂抗体和抗β2糖蛋白I 抗体密切相关。在体外凝血功能试验中，狼疮抗凝物通过与凝血因子竞争性结合磷脂表面来抑制凝血反应，导致凝血反应时间延长。最早狼疮抗凝物是在具有出血倾向的系统系红斑狼疮患者中被发现，但其发生与系统性自身免疫疾病并不完全相关。同时，与正常人群相比，绝大多数狼疮抗凝物阳性患者的出血风险并未增加，反而更容易罹患血栓性疾病[5]。虽然狼疮抗凝物的存在导致体外凝血试验所测定的凝血反应活性下降，但其在体内对同样发生于磷脂表面的抗凝反应也产生抑制作用，能够减缓活化蛋白C 对活化的凝血因子Ⅴ的灭活，阻碍抗凝血酶与凝血酶形成复合物，同时促进血小板的激活和活化[6]。因此，狼疮抗凝物可影响凝血与抗凝反应之间的平衡，促进体内血液高凝，产生了血栓形成的获得性危险因素。抗磷脂综合征的患者由于存在狼疮抗凝物等抗磷脂抗体的病理作用，从而导致了动静脉血栓及复发性流产等临床表现[7]。

二、狼疮抗凝物的实验室检测

狼疮抗凝物的检测是临床诊断抗磷脂综合征的关键[8]。依赖磷脂的凝血试验，如APTT 法和dRVVT 法是国际上最常用的2 种检测方法。狼疮抗凝物的存在会导致APTT（内源性途径及共同途径）和dRVVT（共同途径）试验中的凝血时间延长，因此被广泛作为狼疮抗凝物的筛查试验[2,9]。在试验体系内添加高浓度磷脂成分以使患者延长的凝血时间缩短的确证试验，则是实验室诊断狼疮抗凝物的重要环节[10]。同时，为了与凝血因子缺陷所致的APTT延长相鉴别，特别是先天性凝血因子缺陷造成的凝血时间延长进行鉴别，通常还需要进行混合试验，即将患者血浆与正常人血浆1∶1 混合，观察延长的凝血时间是否可被纠正[3,11]。国际血栓与止血学会在其2009 指南中推荐，狼疮抗凝物的检测顺序为筛选试验、混合试验、确证试验；而2014 年CLSI 关于狼疮抗凝物检测指南——CLSI 2014（H60）文件（以下简称CLSI 指南）则建议检测流程为筛选试验、确证试验、混合试验。但在临床实践中，对混合试验在狼疮抗凝物诊断中的必要性尚存在争论[12]。CLSI 指南中明确提出，狼疮抗凝物的复合试验应包括混合纠正试验，但并非必要，应根据患者已有检测结果和临床症状来决定是否需要作进一步试验以明确诊断[3]。

图2 dRVVT 标准化比值分别与APTT(病浆)、R1、R2 关系的散点图

综上，本研究结果显示，dRVVT 确证试验与混合试验的结果间具有显著相关性，但并非严格的线性相关。基于原理上的差别，本研究认为2 种检测方法在狼疮抗凝物检测中仍具有相对的独立性，并不可完全替代。两者相结合的复合实验可以提高狼疮抗凝物的阳性率和准确率[13-14]。总之，基于共同途径dRVVT 法的筛选、确证试验是国际上检测狼疮抗凝物较常用的方法之一，但对于弱阳性的患者或结果难以解释时，需要结合混合试验结果，以帮助鉴别由于凝血因子缺乏及其抗体所造成的APTT检测结果延长。虽然本研究显示，确证试验与混合试验结果间具有较强的相关性，但在实验室人力、物力允许的情况下，仍建议将二者相结合进行分析，从而提高狼疮抗凝物的检出率，降低误诊率和漏诊率。