PTTG1在D-GalN/TNF-α所致LO2肝细胞损伤中的变化及对细胞凋亡的影响

沙菲菲　田轩　周浩雄　王家玉　郭云蔚

【摘要】目的 探讨垂体肿瘤转化基因1（PTTG1）在D-半乳糖胺（D-GalN）/TNF-α所致LO2肝细胞损伤中的变化，以及对细胞凋亡的影响和机制。方法 通过蛋白免疫印迹法和免疫组织化学检测D-GalN/TNF-α作用前后LO2肝细胞中PTTG1的表达情况，使用PTTG1 shRNA慢病毒建立PTTG1干扰的LO2肝细胞稳转株，并通过蛋白免疫印迹法和RT-PCR检测细胞凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3和内质网应激通路相关基因糖调节蛋白（GRP 78）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的表达。结果 D-GalN/TNF-α作用于LO2肝细胞0.5 h后PTTG1蛋白表达开始逐渐增加，1 h至24 h后PTTG1蛋白表达均高于未处理组（P均< 0.05）;与未处理组相比，D-GalN/TNF-α作用6 h后的LO2肝细胞免疫组织化学PTTG1阳性细胞数增加（P均< 0.05）。与阴性对照组相比，PTTG1稳定干扰的 LO2肝细胞中的cleaved Caspase-3及GRP 78、CHOP表达增加（P < 0.05）。结论 PTTG1在D-GalN/TNF-α所致的LO2肝细胞损伤中表达增加，且干扰PTTG1的表达可促进LO2肝细胞凋亡并激活GRP 78/CHOP内质网应激通路。

【关键词】垂体肿瘤转化基因1;肝细胞损伤;凋亡;内质网应激

【Abstract】Objective To investigate the variation of pituitary tumor transforming gene 1 （PTTG1） expression in D-GalN/TNF-α-induced LO2 cell injury， evaluate the effect on cell apoptosis and unravel its underlying mechanism. Methods The expression levels of PTTG1 in the LO2 cells before and after D-GalN/TNF-αtreatment were detected by western blot and immunohistochemical staining. PTTG1-interfered LO2 cells were established by stably transfected with shRNA lentivirus targeting PTTG1 gene. The expression levels of apoptosis-related protein cleaved Caspase-3 and endoplasmic-reticulum-stress-related genes GRP 78 and CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein （CHOP） were determined by Western blot and RT-PCR. Results The expression of PTTG1 protein in the LO2 cells was gradually up-regulated at 0.5 h after treated with D-GalN/TNF-α， which was significantly higher than that in the untreated group at 1-24 h after treatment （all P < 0.05）. Compared with the value in the untreated group， the quantity of D-GalN/TNF-α-treated LO2 cells with positive PTTG1 was significantly increased （P < 0.05）. The expression levels of cleaved Caspase-3， GRP 78 and CHOP in the PTTG1-interfered LO2 cells were significantly higher compared with those in the negative controls （all P < 0.05）. Conclusions PTTG1 expression is up-regulated in D-GalN/TNF-α-induced LO2 cell injury. Interfering PTTG1 expression can promote the LO2 cell apoptosis and activate the GRP 78/CHOP endoplasmic reticulum stress signaling pathway.

【Key words】Pituitary tumor transforming gene 1;Liver cell injury;Apoptosis;

Endoplasmic reticulum stress

肝細胞损伤由多种因素如病毒感染、缺血缺氧、肝毒性物质作用等引起，长期肝损伤导致疾病向肝纤维化、肝硬化甚至肝癌发展。肝细胞凋亡对于清除外来刺激、维持稳态和肝脏疾病的发生发展都起着重要作用，而内质网应激是导致肝细胞凋亡的重要机制之一[1]。垂体肿瘤转化基因1（PTTG1）是于1997年在大鼠垂体肿瘤中首次被发现的癌基因，在正常人体大部分组织中低表达，而在许多肿瘤组织中表达显著升高，如垂体瘤、甲状腺癌、肝癌等[2-4]。PTTG1在细胞增殖、凋亡、DNA损伤修复等过程中起重要作用，其中，研究发现PTTG1对细胞凋亡的影响在不同的组织、细胞中既有诱导亦有抑制[5-7]。D-半乳糖胺（D-GalN）可通过增加肝细胞对肝毒性物质的敏感性增强TNF-α的促凋亡作用[8]。本研究通过观察PTTG1在D-GalN/TNF-α诱导的LO2人正常肝细胞损伤过程中的变化、干扰LO2肝细胞中PTTG1的表达并观察其与细胞凋亡和内质网应激的关系，探讨PTTG1在LO2肝细胞损伤过程中的作用机制。

材料与方法

一、材 料

LO2人正常肝细胞系由中国科学院干细胞库提供。DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶和嘌呤霉素均购自美国Gibco公司;D-GalN购自Sigma公司;TNF-α购自R&D公司;RNA快速提取试剂盒购自奕杉生物;ReverTra  Ace cDNA合成试剂盒购自TOYOBO公司;qRT-PCR SYBR Green Kit购自南京诺唯赞生物科技公司。β-actin单克隆抗体购自Sigma公司，PTTG1单克隆抗体购自Abcam公司，GRP 78 抗体购自ABclonal公司 ，CHOP、cleaved Caspase-3及WB二抗购自Cell Signaling Technology公司。免疫组织化學（免疫组化）二抗购于碧云天生物技术公司。PTTG1 shRNA慢病毒及阴性对照病毒由上海吉凯基因公司构建。

二、方 法

1. 细胞培养与处理

用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养LO2肝细胞，置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养。待细胞处于对数生长期时，0.25%胰酶消化后传代、铺板。在探究LO2肝细胞中PTTG1在D-GalN/TNF-α作用下的变化情况实验中，各处理组分别加入D-GalN （100 mg/ml）/TNF-α（40 ng/ml）处理0.5、1、6、12、24 h，设立不作处理的空白对照组。在细胞免疫组化染色实验中，处理组加入D-GalN（100 mg/ml）/TNF-α（40 ng/ml）作用6 h，空白对照组不做处理为未处理组。

2. 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达

向各组细胞中加入适量含蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液，冰上裂解30 min后用细胞刮收集细胞，用BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白，半干转法转移蛋白至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h，加入对应一抗后4℃孵育过夜，TBST冲洗，加入对应二抗室温孵育2 h，TBST冲洗，ECL发光显像。

3. 实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测mRNA表达

根据RNA快速提取试剂盒说明书提取各组细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA纯度与浓度，逆转录后测定目的基因的引物序列见表1。

4. 细胞免疫组化染色

细胞爬片，处理组加入D-GalN/TNF-α刺激6 h，磷酸盐缓冲液（PBS）浸洗，4%多聚甲醛固定20 min，PBS浸洗，0.5%Triton X-100室温孵育15 min，PBS浸洗，3%H2O2孵育10 min，BSA封闭0.5 h，加入PTTG1单克隆抗体4℃湿盒孵育过夜，PBS浸洗，加入对应二抗室温孵育2 h，PBS浸洗后DAB显色，苏木素染核。封片后于显微镜下放大200倍观察，取随机3个视野拍照、计数PTTG1免疫组化染色阳性细胞数并分析。

5. LO2肝细胞稳转株的构建

根据shRNA慢病毒转染说明书将3种PTTG1 shRNA慢病毒及阴性对照病毒转染LO2肝细胞，低倍镜下观察到GFP荧光表达后，加入嘌呤霉素1 μg/ml进行抗性筛选。扩增细胞并取部分细胞通过蛋白免疫印迹法和RT-PCR测定PTTG1的干扰效果，挑选出最优干扰PTTG1 shRNA慢病毒做下一步实验，转染阴性对照病毒做阴性对照组。

三、统计学处理

RT-PCR结果用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。采用Graph Padprism 8.0、SPSS 23.0进行数据分析并作图。正态分布数据以表示，2组数据比较采用独立样本t检验;多组间比较采用方差分析，多重比较采用Dunnett-t检验或Dunnetts t3检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、D-GalN/TNF-α促进LO2肝细胞的PTTG1表达

蛋白免疫印迹法灰度分析结果显示，未处理组PTTG1/β-actin为0.48±0.11，D-GalN/TNF-α处理0.5、1、6、12、24 h后PTTG1/β-actin值依次

为0.59±0.15、0.83±0.14、0.85±0.084、0.89 ±0.10、0.88±0.10，1 h后各处理组PTTG1蛋白表达均高于未处理组（F = 6.805，P < 0.05;0.5h处理组与未处理组比较P > 0.05，1、6、12、24 h处理组与未处理组比较P均< 0.05）（图1A）。D-GalN/TNF-α作用于LO2肝细胞6 h，免疫组化染色PTTG1阳性率增加（t = -3.987，P < 0.05） （图1B）。

二、PTTG1 shRNA慢病毒干扰的LO2肝细胞稳转株的构建

3种PTTG1 shRNA慢病毒及阴性对照均成功感染LO2肝细胞，低倍镜下可观察到共表达的GFP荧光信号（图2A）。RT-PCR和蛋白免疫印迹法结果显示，PTTG1 shRNA-2的干扰效果最好

（F RT-PCR =245.908，FWB = 12.882，3种慢病毒感染组与阴性对照组比较P均< 0.05），可有效地沉默PTTG1基因（图2B、C）。后续实验将使用PTTG1 shRNA-2干扰后经嘌呤霉素抗性筛选稳定的LO2肝细胞进行。

三、PTTG1基因沉默对LO2肝细胞凋亡的影响

蛋白免疫印迹法结果显示，与阴性对照组相比，PTTG1稳定干扰的LO2肝细胞中cleaved Caspase-3表达增加，灰度分析显示蛋白相对表达量cleaved Caspase-3/β-actin值PTTG1干扰组为0.31±0.04，高于阴性对照组的0.21±0.02 （t = -4.484，P < 0.05）（图3）。

四、PTTG1对内质网应激通路的影响

RT-PCR和蛋白免疫印迹法结果显示，与阴性对照相比，PTTG1稳定干扰的LO2肝细胞中GRP 78及CHOP的mRNA和蛋白表达均增加。RT-PCR结果显示PTTG1干扰组GRP 78及CHOP的mRNA相对表达量分别为1.80±0.38、1.80±0.23，均高于阴性对照组的1.00±0.14、1.00±0.21（tGRP 78 = -4.421，tCHOP = -5.401，P均 < 0.05）（图4A）;蛋

白免疫印迹法灰度分析结果显示PTTG1干扰组GRP 78/β-actin及CHOP/β-actin值分别为0.92±0.03、0.42±0.59，均高于阴性对照组的0.56±0.04、0.18 ±0.04（tGRP 78/β-actin = -11.418，tCHOP/β-actin = -6.043，P均 < 0.05）（圖4B）。

讨论

PTTG1是1997年首次被发现的癌基因，并被证实其为有丝分裂过程中介导姐妹染色单体分离的关键蛋白“分离酶抑制蛋白（securin）”[2， 9]。其主要位于胞浆中，小部分位于细胞核，在细胞增殖、DNA的损伤和修复、代谢、血管生成等生理过程中起重要作用[9-12]。PTTG1参与多种肝脏疾病发生发展。如HBV、HCV感染能促进PTTG1的表达和转录激活作用，其中PTTG1还可正向调控HBV，增强其表达和复制[13-16]。大量生物信息学分析表明，PTTG1在肝癌组织和正常组织中有显著的差异表达，在信号通路富集分析中发现，肝癌中上调的差异表达基因主要富集的信号通路与代谢、细胞周期和生物氧化相关[17]。本研究证实PTTG1亦参与了D-GalN/TNF-α所导致的LO2肝细胞损伤的过程。

在各种因素导致的肝损伤性病变中，往往伴随着肝细胞凋亡的发生。凋亡又称程序性死亡，是细胞保持自我稳态的一种机制，对于维持自身的更新、清除外来刺激和受损细胞起着重要作用[18]。肝细胞凋亡过强或凋亡不足都会导致稳态失衡，进而导致各种急性、慢性肝脏疾病的发生。肝细胞凋亡主要涉及3个途径：外在途径、内在途径和内质网应激（ERS）[1， 18-19]。ERS过程中激活未折叠蛋白反应，内质网腔内未折叠或错误折叠的蛋白通过结合内质网分子伴侣GRP 78，促使其从3种跨膜受体蛋白PERK、IRE1、ATF6上解离，激活后者触发的信号级联反应。在此过程中，前凋亡基因CHOP的转录上调，而CHOP的过度表达可导致细胞凋亡的发生[20]。

PTTG1对细胞凋亡的影响，目前的研究表明其在不同的组织、细胞中作用不尽相同。干扰SH-J1肝癌细胞中PTTG1的表达后，细胞凋亡增加，并激活了p53[5]。同样，干扰HepG2、SMCC-7721肝癌细胞系中PTTG1的表达亦促进了细胞凋亡[21]。相反，在MCF-7乳腺癌细胞、HEK293细胞和p53突变型的PC-3人前列腺癌细胞中的研究发现，PTTG1的过表达通过p53依赖途径促进了细胞凋亡[7]。PTTG1对于细胞凋亡的影响是否存在组织或细胞特异性目前尚无定论，但研究至少表明PTTG1部分通过p53介导的信号通路对细胞凋亡产生影响，同时还报道了PTTG1可通过p53非依赖途径调控细胞凋亡[7]。而本研究显示，干扰PTTG1在LO2肝细胞中的表达，细胞凋亡增加，且上调了ERS通路GRP78/CHOP。我们推测，PTTG1基因在调控正常肝细胞急性损伤引发的细胞凋亡过程中可能起到防止细胞凋亡过度的作用。

综上所述，PTTG1参与了D-GalN/TNF-α所致的LO2肝细胞损伤过程且表达增加，其作用与ERS通路GRP 78/CHOP所致的细胞凋亡相关。PTTG1对细胞凋亡的影响是否在肝细胞中特异性地表现为抑制作用，及其生理和病理调控机制，本研究目前只在LO2人正常肝细胞上进行了初步探讨，后续将在其他正常肝细胞系和肝癌细胞系以及体内进行验证。本研究结果对进一步阐明PTTG1在肝脏疾病发生发展过程中的作用机制具有重要意义。

参 考 文 献

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（收稿日期：2019-12-25）

（本文编辑：杨江瑜）