晚期早产儿喂养不耐受肠道菌群研究

任建东 李 军 严 洁 马 岩 金 华 顾 岚 高 丽 顾震宇

苏州市第九人民医院新生儿科（江苏苏州 215200）

随着围生医学及新生儿重症监护技术的发展，早产儿的就诊率及存活率逐步提高，而早产儿各种相关并发症的发生率也随之升高，其中喂养不耐受是早产儿治疗过程中普遍存在的问题之一，可影响早产儿的近期及远期预后。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年1月至12月苏州市第九人民医院新生儿重症监护病房收治的胎龄34周以上的早产儿为研究对象。研究对象入选标准：①出生24小时内；②出生胎龄34～36+6周；③母亲无产前感染及胎膜早破；④入院后以早产儿配方奶喂养；④住院期间未使用过抗生素；⑤剔除合并严重并发症者，如罹患感染、循环呼吸系统疾病、出生窒息、先天性消化道畸形。结合《实用新生儿学》第4版中的喂养不耐受诊断及Dutta等[1]发布的《喂养指南》，符合以下任一种情况者为喂养不耐受（不耐受组）：①喂奶后发生反流或频繁呕吐（≥3次/d）；②奶量减少或＞3天奶量不增；③胃内含有咖啡色样物；④大便隐血阳性；⑤鼻饲喂养时，潴留量＞5 mL/kg或大于上次喂养量的1/2。喂养不耐受患儿经过干预后喂养不耐受症状基本消失者为缓解组。无喂养不耐受发生者为对照组。

研究经苏州市第九人民医院伦理和安全委员会批准，取得受试对象家长的知情同意并签署知情同意书。研究过程遵循医学伦理委员会所制定的伦理学标准。

1.2 方法

1.2.1 粪便标本采集、处理及菌群检测 分别留取喂养不耐受早产儿喂养不耐受时、缓解后，以及同期对照组的粪便标本。取样时使用无菌棉拭子，插入研究对象粪便中部内侧取样，将足量粪便样本转移到采集管保存液中，2小时内将采集管置入-20 ℃冰箱冷冻保存，并在48小时内放入-76 ℃超低温冰箱保存。样本交由苏州协云基因科技有限公司进行检测，检测流程为核酸提取、DNA质检、文库构建、文库质检、测序和数据分析。

1.2.2 组间菌落比较 从各样本在门、属层级上的相对丰度分析表出发，获得各分组在门、属层级上的相对丰度表，并分析各分组在门、属水平上的群落结构及差异。

1.2.3 Alpha多样性 可反映物种丰富度和均匀度以及测序深度。使用的Alpha多样性指数有：Observed_otus、Chao1指数、Shannon指数。Observed_otus：样本中直观统计的OTU数，数值越高表明样本物种丰富度越高。Chao1指数：样本中所含物种数目的指数，其值越大样本中物种总数越多。Shannon指数：最常用来估算样本中微生物多样性及均匀度的指数，其值越大，说明群落物种丰度以及均匀度都很高。

1.3 统计学分析

运用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

纳入喂养不耐受早产儿30例，分别在喂养不耐受时及缓解时收集粪便样本；对照组30例。不耐受组与对照组的性别、出生胎龄、出生体质量、Apgar 评分、分娩方式的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 门水平粪便菌群组成及差异分析

不耐受组、缓解组和对照组粪便样本均以厚壁菌门（Firmicute）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻菌门（Cyanobacteria）为主，在各组样本中所占比例均达99%以上；但三组之间拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度差异均有统计学意义（P＜0.05）。两两比较发现，不耐受组与缓解组的拟杆菌门和放线菌门的相对丰度均低于对照组，不耐受组变形菌门的相对丰度高于对照组及缓解组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.3 属水平粪便菌群组成及差异分析

三组粪便样本均以肠球菌属（Enterococcus）、链球菌属（Streptococcus）、拟杆菌属、梭菌属（Clostridium）、葡萄球菌属（Staphylococcus）及双歧杆菌属（Bifidobacterium）为主，在各组样本中所占比例均达99%以上，三组之间各菌属的相对丰度差异均有统计学意义（P＜0.05）。两两比较发现，不耐受组肠球菌属和拟杆菌属的相对丰度低于对照组与缓解组；不耐受组链球菌属和葡萄球菌属的相对丰度高于对照组与缓解组；不耐受组与对照组的梭菌属的相对丰度低于缓解组；不耐受组与缓解组的双歧杆菌属对丰度低于对照组；差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表1 两组患儿一般情况比较(±s)

表1 两组患儿一般情况比较(±s)

2.4 三组粪便菌群多样性比较

三组间Observed_otus 数值、Chao 1 指数和Shannon指数的差异均有统计学意义（P＜0.05）。两两比较发现，不耐受组的Observed_otus 数值、Chao1指数和Shannon 指数均低于对照组及缓解组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

3 讨论

由于早产儿孕周小，胃肠道功能尚未发育成熟，胃肠道运动功能及神经内分泌功能发育不成熟，肠道菌群建立不足，肠道屏障功能不完善，肠道免疫功能差，易致早产儿发生喂养不耐受[2]。而喂养不耐受的发生可致早产儿发生宫外发育迟缓，从而延长住院时间，降低早产儿存活率，甚至影响智力发育和远期预后[3]。越来越多的研究表明，肠道菌群结构建立的不完善是早产儿发生不耐受的原因之一。

肠道中定植的细菌具有数量巨大、多样化、复杂性和动态性的特点，构成了人体的肠道微生物菌群[4]，在维持人体健康中发挥着重要的作用。肠道菌群定植是一个复杂的过程。最近研究发现，对脐带、胎盘、羊水、胎粪及胎膜等进行16 S rDNA 基因测序检测，均可检出微生物DNA，提示胎儿在母体妊娠阶段可能已形成自有微生态[5-6]。新生儿肠道菌群定植过程中，开始定植的细菌为需氧菌与兼性厌氧菌，这些细菌消耗肠道内氧气，为厌氧菌创造缺氧环境[7]。生命早期肠道菌群的建立可受到诸多内、外界因素的影响，如遗传因素、宫内菌群暴露、分娩方式、喂养方式、胎龄、抗生素的使用、生活环境等[8-9]。而早产儿由于胃肠道不成熟，出生后常规氧疗使肠道由宫内低氧环境转向富氧环境，处于新生儿重症监护室相对无菌的环境中，缺乏母乳喂养，抗生素的应用及医疗操作等[4]，以致早产儿肠道细菌定植模式往往不同于足月儿，不仅是肠道菌群的定植延迟，而且还存在菌种类别及多样性降低，从而不能形成完整的肠道黏膜的微生态屏障[10]。

表2 门水平三组粪便菌群相对丰度比较(±s)

表2 门水平三组粪便菌群相对丰度比较(±s)

注：1)与对照组比较，P＜0.05；2)与缓解组比较，P＜0.05

表3 属水平三组粪便菌群相对丰度比较(±s)

表3 属水平三组粪便菌群相对丰度比较(±s)

注：1)与对照组比较，P＜0.05；2)与缓解组比较，P＜0.05

表4 三组粪便菌群多样性比较(±s)

表4 三组粪便菌群多样性比较(±s)

注：1)与对照组比较，P＜0.05；2)与缓解组比较，P＜0.05

本研究采取Illumina 高通量测序技术，高通量测序技术是基于16S rDNA的微生物群落分析中的要点，能产生测序覆盖深度极其深的测序数据，对数据来源的微生物物种进行分析，能估计出微生物群落的微生物种的组成。因此，Illumina 高通量测序技术可以发现低丰度细菌或未知的细菌，具有测序快、准确度高、通量高的特点，能够全面分析肠道菌群的多样性、丰度和物种构成[11]。

本研究结果显示，三组粪便样本的主要菌群种类相同，但是在门水平及属水平上三组粪便标本的各菌群所占比例均存在差异。门水平均以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻菌门为主。三组粪便菌群的厚壁菌门相对丰度比较无显著差异，厚壁菌门为兼性厌氧菌，可利用新生儿肠道丰富的氧气，成为优势菌，但当氧化还原电位降低时，第2 周就失去了这个优势。而在三组粪便标本中，不耐受组变形菌门的相对丰度显著高于对照组及缓解组，对照组拟杆菌门、放线菌门的相对丰度显著高于不耐受组及缓解组。拟杆菌在健康人的粪便中是绝对优势菌，其在帮助宿主分解多糖提高营养利用率，加快肠黏膜血管形成及免疫系统发育，维持肠道微生态平衡等方面起重要作用[12]。有研究表明炎症性肠病患者肠道微生物中拟杆菌门比例下降，而变形菌门比例升高[13]。属水平三组粪便样本菌群均以肠球菌属、链球菌属、拟杆菌属、梭菌属、葡萄球菌属及双歧杆菌属为主，不耐受组的肠球菌及拟杆菌属的相对丰度显著低于对照组及缓解组，缓解组梭菌属的相对丰度则高于不耐受组及对照组，而对照组双歧杆菌属的相对丰度高于不耐受组及缓解组，不耐受组链球菌属及葡萄球菌属的相对丰度高于对照组及缓解组。有研究表明肠球菌属中常见的粪肠球菌，可以通过自身的代谢产物和其他肠道菌群一起调整机体微生态的平衡，减轻宿主的炎症反应，对肠道起到保护性作用[14]。拟杆菌属、梭菌属等，它们直接影响机体的定植抗力，对宿主的健康发挥重要的作用。双歧杆菌是人体肠道中最重要的益生菌之一，它对维持肠道菌群的平衡、提高机体免疫力和抗感染力以及控制内毒素等都有着非常重要的作用，其数量的增加可以修复损伤肠壁，降低受损肠壁的通透性，是人体健康的主要守护菌群[15]。本研究中不耐受组的肠球菌属、拟杆菌属、梭菌属及双歧杆菌属的相对丰度均较低，而链球菌属及葡萄球菌属的相对丰度偏高，它们具有致病性或潜在致病性，可引起细菌移位并导致内源性感染疾病的发生。

国内外研究显示，喂养不耐受的新生儿肠道菌群多样性低于健康新生儿，而在喂养不耐受缓解后其肠道菌群多样性基本与健康儿无异[16]，与本研究结果一致。本研究结果显示反映物种丰富度的Observed_otus、Chao 指数及反映微生物多样性及均匀度的Shannon指数，不耐受组均显著低于对照组及缓解组，而对照组及缓解组之间无显著差异。

综上所述，各菌群在三组粪便样本中相对丰度的差异与喂养不耐受的发生有密切联系，且喂养不耐受的发生与肠道菌群多样性的降低密切相关，并随着喂养不耐受症状的缓解，肠道菌群的多样性亦在逐渐恢复。肠道内有益菌的减少，致病菌或条件致病菌的增加、侵入致使体内微生态的失衡，从而使患儿肠道不能形成完整的肠道黏膜微生态屏障而影响机体胃肠功能的发展及成熟，成为导致早产儿发生喂养不耐受的诱因之一，但是具体机制及关系还需进一步研究。我们在临床工作中需尽量减少不利于早产儿肠道菌群建立的因素，并且采取有效措施及早帮助早产儿建立正常的肠道菌群，从而减少喂养不耐受的发生，提高早产儿的生存质量。我们将进一步研究早产儿口服益生菌后喂养不耐受发生情况及其肠道菌群变化。