血清miR-200c-3p 表达水平对判断新生儿呼吸窘迫综合征严重程度和预后的价值

古裕鸟 霍开明 庄秀娟 蒋家敏 吴小红 黄旭芳

海南医学院第二附属医院儿科（海南海口 570311）

新生儿呼吸窘迫综合征（neonatal respiratory distress syndrome，NRDS）是指原发性或继发性肺泡表面活性物质减少导致的呼吸系统疾病，其病情进展快、病死率较高，是一种严重威胁新生儿生命的呼吸危重症[1]。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）作为一类新型的基因调控分子，可通过影响靶基因的表达而调控炎症通路和免疫反应，在急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）发病过程中起重要作用[2]。近年研究发现，miR-200c-3p在炎症性肺疾病中发生表达变化，参与多个信号通路和各种免疫炎症反应过程，在ARDS发生发展过程中发挥重要的调控作用[3-4]。然而，miR-200c-3p在NRDS中的表达及其临床意义尚未有报道。本研究通过检测ARDS新生儿血清miR-200c-3p表达水平，分析其对NRDS预后评估的价值，旨在为NRDS救治提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性选取2016 年6 月至2019 年6 月海南医学院第二附属医院收治的NRDS新生儿。纳入标准：①符合《新生儿急性呼吸窘迫综合征蒙特勒(2017年版)》诊断标准[5]；②经影像学检查（X 线胸片显示双肺弥漫性阴影伴肺水肿改变，超声心动图检查无左心房高压表现），并结合临床症状及体征确诊；③急性起病，重症监护室机械通气时间≥72小时，胎龄＞32周。排除标准：①肺外严重感染；②原发性肺泡表面活性物质缺乏、先天性心脏病、先天性代谢紊乱；③肺和胸壁畸形及其他严重的先天畸形。

以新生儿诊断为NRDS为研究起点，痊愈出院或死亡作为研究终点，将其分为生存组（治愈和病情好转出院）和死亡组（病情危重放弃治疗和死亡）。患儿依据入院24 小时内首次胸片结果及病情严重程度分为轻度组（Ⅰ、Ⅱ级）和重度组（Ⅲ、Ⅳ级）。所有患儿均有新生儿ARDS特征性的X 线表现。Ⅰ级：两肺野透亮度明显降低，可见均匀散在的细小颗粒和网状阴影；Ⅱ级：除Ⅰ级变化加重外，可见支气管充气征，延伸至肺野中外带；Ⅲ级：病变加重，肺野透亮度更加降低，心缘、膈面模糊；Ⅳ级：整个肺野呈白肺，支气管充气征更加明显，似秃叶树枝。所有患儿确诊后12 小时内应用新生儿急性生理学评分围生期补充II（Perinatal Supplement of Acute Physiological Score for Neonates II，SNAPPE-II）进行评分，评分范围0～162分，分值越高，病情越重。

本研究经医院伦理委员会通过，患儿家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 记录患儿入院时的胎龄、性别、出生体质量、病因及母亲的基本情况。

1.2.2 miR-200c-3p检测 所有患儿于确诊次日采集空腹静脉血5 mL置未加抗凝剂的离心管中，离心分离血清（离心力2 054×g、离心时间10 min），-80℃低温冰箱保存。应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription试剂盒逆转录已定量的RNA，选用U 6 作为内参。反应体系为15 μL：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μL 100 mmol/L脱氧核糖核苷酸（dNTPs），1.00 μL逆转录酶（50 U/μL），10×反转录缓冲液1.50 μL，0.19 μL RNase抑制剂（20 U/μL），4.16 μL无菌三蒸水。反应参数：16℃反应30 min，42℃反应30 min，85℃反应5 min，4℃恒温放置保存，每个反应均为1个循环。在ABI 7500型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量聚合酶链反应。反应体系为20 μL：1 μL 引物及探针Mix（20×），10 μL TaqMan通用混合物溶液，1.33 μL反转录产物cDNA，7.67 μL无核酸酶的水。扩增条件：95 ℃预变性10 min 1个循环，95 ℃变性15 s、60 ℃复性60 s进行45个循环，实验重复3次。采用2-ΔΔCt法计算miR-200c-3p的相对表达水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布计量资料以中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验。绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析血清miR-200c-3p表达水平及SNAPPE-Ⅱ评分预测NRDS死亡的价值，曲线下面积（area under cure，AUC）比较采用Z检验。相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿基本情况

102例NRDS患儿胎龄32～41周，中位胎龄37.0周；出生体质量2 690 g（2 560～2 920）g；足月儿46例，早产儿56例。46例足月儿中男29例、女17例，胎龄37～41周，中位胎龄39.5周，出生体质量2 862 g（2 685～3 170）g；56例早产儿中男35例、女21例，胎龄32～37周，中位胎龄34.80周，出生体质量2 530 g（2 382～2 610）g。

2.2 死亡组和生存组一般资料比较

死亡组和生存组性别比、胎龄、出生体质量、病因构成、母亲年龄以及双胎、剖宫产及羊水异常比例比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2 .3 死亡组和生存组miR-200c-3p水平及SNAPPE-Ⅱ评分比较

死亡组血清miR-200 c-3p 表达水平及SNAPPE-Ⅱ评分均明显高于生存组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

2.4 重度组和轻度组miR-200 c-3p 表达水平及SNAPPE-Ⅱ评分比较

重度组血清miR-200c-3p 表达水平及SNAPPE-Ⅱ评分、病死率均明显高于轻度组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.5 血清miR-200 c-3p 及SNAPPE-Ⅱ评分预测NRDS死亡的价值

血清miR-200c-3p表达水平及SNAPPE-Ⅱ评分预测NRDS 患儿死亡的最佳截值分别为0.52、23.60分。miR-200c-3p联合SNAPPE-Ⅱ评分预测NRDS患儿死亡的AUC为0.93（95%CI：0.87～0.98），明显高于单项miR-200c-3p（0.84，95%CI：0.78～0.90）及SNAPPE-Ⅱ评分（0.80，95%CI：0.75～0.86），差异有统计学意义（Z=5.32、5.87，P均＜0.05），其灵敏度和特异度为94.0%和88.5%。见表3、图1。

2.6 血清miR-200c-3p水平与SNAPPE-Ⅱ评分相关性分析

Pearson 相关分析显示，NRDS 患儿血清miR-200 c-3p 表达水平与SNAPPE-Ⅱ评分呈显著正相关（r=0.84，P＜0.001）。

表1 死亡组和生存组临床资料比较

图1 miR-200c-3p 水平及SNAPPE-Ⅱ评分预测NRDS 死亡ROC 曲线

表2 重度和轻度组miR-200c-3p水平及SNAPPE-Ⅱ评分比较

3 讨论

目前NRDS缺乏特效治疗手段，仍是以呼吸支持、肺表面活性物质替代、体外膜肺氧合、营养支持及液体管理等对症及综合治疗为主，治疗难度较大，病死率仍然较高。因此，如何早期预测NRDS的预后，进而针对其进行综合治疗，对提高患儿的预后及降低病死率具有重要意义。miRNA是一类由18～25个核苷酸组成的小分子非编码RNA，通过miRNA 剪切和抑制蛋白质翻译的方式参与靶基因的转录后调控，在细胞的分化、增殖、凋亡、血管生成以及炎症免疫反应中发挥重要作用[6-7]。相关研究表明，miRNA 参与了ARDS的发生、发展，在ARDS 炎症反应和细胞凋亡中起重要的调控作用，有望成为ARDS的新型生物标志物和治疗新靶点[8]。另有研究发现，miRNA在ARDS中发生表达变化，miRNA 参与上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞的病理生理过程，决定了ARDS患者的病程进展和预后[9]。SNAPPE-Ⅱ评分是一种应用较广的新生儿危重病例评分系统，对新生儿危重症有良好预测价值，能准确地预测多种新生儿危重疾病的预后[10]。

表3 miR-200c-3p水平及SNAPPE-Ⅱ评分预测NRDS死亡的价值

本研究显示，死亡组血清miR-200 c-3p 表达水平及SNAPPE-II评分均明显高于生存组，重度组血清miR-200c-3p表达水平、SNAPPE-II评分及病死率均明显高于轻度组，提示血清miR-200c-3p表达水平及SNAPPE-II评分与NRDS的病情严重程度有关，miR-200c-3p表达水平高的RDS新生儿预后较差，发生死亡的风险较高。相关研究发现，血清miRNA表达水平在NRDS中明显升高，且与NRDS病情严重程度和预后密切相关[11]。另有研究表明，采用SNAPPE-II评分对RDS患儿预后进行评估，可预测其死亡的发生风险，SNAPPE-II评分越高，RDS患儿的死亡风险越大[12]。本研究相关分析显示，NRDS患儿血清miR-200c-3p表达水平与SNAPPE-II评分呈正相关，进一步说明血清miR-200 c-3p 表达水平与NRDS 的病情严重程度密切相关。本研究应用ROC曲线分析结果显示，血清miR-200c-3p表达水平及SNAPPE-II评分预测NRDS死亡的最佳截值分别为0.52、23.60分，miR-200c-3p联合SNAPPE-II评分预测NRDS死亡的AUC最大，其灵敏度和特异度较好。相关研究认为，miRNA通过作用于靶mRNA，调节基因表达，参与肺的发育及损伤修复过程，并在NRDS中发生差异表达，可作为NRDS的潜在治疗靶点[13]。有研究发现，miR-200 c-3p 与NRDS 的疾病发展和严重性有关，可作为NRDS 预后评估的生物标志物，同时也为临床治疗NRDS 提供新的思路[14]。另有研究表明，SNAPPE-II 评分越高，NRDS死亡风险越大，早期进行SNAPPE-II评分评估，有利于预测NRDS病情危重程度及预后情况，对改善患儿预后具有重要意义[15]。

综上所述，血清miR-200 c-3p 表达水平升高与NRDS病情严重程度及预后相关，miR-200c-3p联合SNAPPE-II评分对NRDS 预后判断具有较高的价值，miR-200c-3p有望作为NRDS潜在的预后标志物和治疗新靶点。但这些研究仍处于初步阶段，今后尚需更多的临床研究进一步证实miR-200c-3p在NRDS中的应用价值，使之成为诊疗NRDS的新途径。