血清miR-124 miR-145检测对急性缺血性脑卒中的诊断价值

刘丽娇 杨秀丽 徐祥辉 秦 毅

1)新乡市第一人民医院神经内科，河南 新乡 453000 2)新乡医学院第三附属医院，河南 新乡 453000

急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke，AIS)发病率约占脑卒中总人数的70.0%[1-2]，并随我国人口老龄化趋势加剧呈增长态势，若未予以及时诊治，可触发炎症反应、氧化应激等一系列缺血级联病理事件，诱导脑血管内皮细胞、神经细胞凋亡及坏死[3-4]。目前诊断AIS多依赖于卒中量表评分、头颅CT或磁共振成像(MRI)影像学手段，但其诊断准确性均有待提高。近年来随着基因芯片技术快速发展，RNA作为疾病诊断的检测生物标志物已成现实。microRNA(miRNA)具有高组织特异性、相对稳定性及体液丰度等特点[5-6]，能通过抑制转录或降解mRNA，达到调节靶基因转录后水平、介导血管生成、凋亡及氧化应激的目的，可作为潜在性组织损伤生物标志物[7-8]。miR-124是脑组织损伤诊断敏感性的循环生物标志物，在脑部神经发育、调控中枢神经功能中起重要作用[9]。miR-145是影响颈动脉粥样硬化(CAS)稳定性的重要基因，与颈动脉狭窄程度具有一定关联性[10]。但临床关于miR-124、miR-145在AIS诊断中的价值尚未完全阐明。本研究以血清miR-124、miR-145为观察指标，探讨其对AIS的诊断价值及与CAS斑块性质关联性。

1 资料和方法

1．1一般资料选取2017-07-2019-10新乡市第一人民医院收治的AIS患者82例为AIS组，男49例，女33例；年龄47～76(62.34±5.15)岁；体重指数18.4～26.4(21.96±1.53)kg/m2；根据美国国立卫生院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)轻度(NIHSS评分≤6分)18例，中度(NIHSS评分7～14分)40例，重度(NIHSS评分≥15分)24例；根据CAS斑块性质分为易损斑块45例，稳定斑块37例；并发症：高血脂12例，高血压25例，糖尿病8例，冠心病15例；有吸烟史15例。另选同期健康体检者82例为对照组，男52例，女30例；年龄48～78(61.86±4.93)岁；体重指数18.1～26.8(22.04±1.62)kg/m2；10例有吸烟史。2组基本资料(年龄、性别、体重指数、吸烟史)均衡可比(P>0.05)。本研究经新乡市第一人民医院医学伦理委员会批准。

1．2选取标准

1．2．1 纳入标准：①均符合《急性缺血性卒中静脉溶栓中国卒中学会科学声明》[11]中的AIS相关标准；②均经头颅CT或MRI等影像学检查确诊为AIS；③首次发病；④均于发病后≤72 h内入院；⑤临床资料完整；⑥患者或家属知情并签署承诺书。

1．2．2 排除标准：①合并急性冠状动脉综合征、瓣膜病、心房颤动、动脉炎及周围血管疾病者；②肝、肾等重要脏器器质性病变者；③合并短暂性脑缺血或脑出血疾病者；④全身感染性疾病者；⑤心源性栓塞型、小动脉闭塞型、其他病因型及不明原因型所致AIS者；⑥近期有免疫抑制剂治疗史者；⑦伴有恶性贫血、血液性疾病、甲状腺功能减退或亢进者；(8)精神行为异常者。

1．3方法采集肘静脉血10 mL，4 ℃条件下3 000 r/min，离心10 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱保存待测。(1)RNA提取：按照mirVana PARIS试剂盒(购自美国ABI公司)说明书分离总RNA。通过RNase Free水洗涤，收集总RNA(100 μl)，同时应用NanoDrop ND-1000核酸定量检测仪(购自美国NanoDrop公司)对RNA浓度、纯度进行检测。(2)实时逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)：引物购自美国MRC Gene公司，根据miScript SYBR Green Kit试剂盒说明书(美国Ambion公司)进行配制反应混合物，每个反应体系为20 μL，使用荧光定量PCR仪(型号LightCy-cler480：购自瑞士罗氏公司)检测。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，重复40个循环实施扩增反应，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s制备溶解曲线。将扩增产物进行电泳，在图像处理系统上分析、计算，得出miR-124、miR-145，GAPDH的光密度，以GAPDH的光密度为参照，求出miR-124、miR-145光密度的变化值(ΔCt)，以2-Ct得到miR-124、miR-145相对表达量。每个反应重复3次。

1．4观察指标(1)对比2组血清miR-124、miR-145水平。(2)对比不同神经缺损程度患者血清miR-124、miR-145水平。(3)采用Logistic多因素回归分析AIS发病影响因素。(4)采用受试者工作特征曲线(ROC)分析血清miR-124、miR-145诊断AIS的价值。(5)对比不同CAS斑块性质患者血清miR-124、miR-145水平。(6)采用Pearson线性相关性分析血清miR-124、miR-145水平与神经功能缺损程度、CAS斑块性质关联性。

2 结果

2．1组血清miR-124、miR-145水平比较由表1可知，AIS组血清miR-124水平低于对照组，miR-145水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

组别nmiR124miR145AIS组822.68±0.898.04±2.62对照组823.89±0.735.28±1.59t值9.5198.155P值<0.001<0.001

2．2不同神经缺损程度患者血清miR-124、miR-145水平比较由表2可知，随神经功能缺损程度的加重，血清miR-124明显降低，血清miR-145水平明显增高(P<0.05)。

表2 不同神经缺损程度患者血清miR-124、miR-145 水平比较Table 2 Serum miR-124 and miR-145 levels in patients withdifferent degrees of neurological

2．3 AIS发病影响因素由表3可知，以是否发生AIS为因变量，将受试者年龄、性别、体质量与血清miR-124、miR-145为自变量实施Logistic回归分析，结果发现，血清miR-124、miR-145为AIS发病的重要影响因素(P<0.05)。

2．4诊断价值由表4、图1可知，经ROC曲线分析，血清miR-145诊断AIS的AUC(0.791)>miR-124(0.717)，以7.25为截断值时，敏感度为64.63%、特异度为90.24%。

2．5不同CAS斑块性质患者血清指标水平比较易损斑块患者血清miR-124低于稳定斑块患者，血清miR-145水平高于稳定斑块患者(P<0.05)。见表5。

表3 AIS发病影响因素的Logistic回归分析结果Table 3 Logistic Regression Analysis Results of AISInfluencing Factors

表4 血清指标诊断AIS的ROC曲线Table 4 ROC curve of serum index for diagnosis of AIS

组别nmiR124miR145易损斑块患者452.36±0.788.72±2.79稳定斑块患者373.07±1.027.21±2.48t值3.5712.563P值0.0010.012

图1 ROC曲线Figure 1 ROC curve

2．6血清指标与神经功能缺损程度、CAS斑块性质关联性由表6、图2、图3可知，Pearson线性相关性分析可知，血清miR-124水平与神经功能缺损程度、CAS斑块性质呈显著负相关，血清miR-145水平与神经功能缺损程度、CAS斑块性质呈显著正相关(P<0.05)。

表6 血清指标与神经功能缺损程度、CAS斑块性质关联性 (n=82)Table 6 Correlation of serum indicators with neurologicaldeficits and CAS plaque properties (n=82)

3 讨论

数据显示，>70.0%AIS患者是由颈动脉血管粥样硬化所致[12-13]。同时相关研究指出，miRNA通过平滑肌细胞表型转化、增殖、迁移、炎性反应及泡沫细胞形成等多个过程调控CAS的发生发展[14-16]。因此动态监测相关miRNA水平变化，对评估AIS病情程度、识别颈动脉血管粥样硬化斑块性质具有重要作用。

miR-124作为中枢神经系统最丰富的miRNA，能够促进小胶质细胞、巨噬细胞转化为M2表型，从而避免神经元损伤[17-18]。LIU等[19]研究发现，血清miR-124水平在AIS患者中呈异常低表达状态，与本研究观点一致。研究[20]也证实，体外miR-124有助于促进抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl的表达，显著增加M2表型的小胶质细胞/巨噬细胞，减轻神经炎症，且还能通过降解RE1沉默转录因子，抑制神经元凋亡，减少缺血性脑损伤、功能障碍，增强神经血管重塑[21]，充分证实血清miR-124水平下调可能是导致AIS的风险因素之一。另外，JI等[22]认为，AIS患者血浆miR-124水平与梗死体积、NIHSS评分均具有正相关关系。同时通过大脑中动脉闭塞小鼠模型还发现[24]，抑制miR-124表达够能显著增加模型小鼠的梗死体积，小鼠颅内注射miR-124拟似物脂质体后，脑梗死面积明显缩小，AIS患者神经功能缺损得到显著缓解。进一步经Logistic多因素回归分析、Pearson线性相关性分析发现，血清miR-124水平是AIS患者的保护因素，与神经功能缺损程度、CAS斑块性质存在明显负相关关系，与上述研究相符，充分证明miR-124低表达可能加重AIS患者神经功能缺损，增加CAS斑块破裂的风险性。

miR-145主要存在于血管平滑肌内，在血管平滑肌细胞表型转换过程中发挥重要作用，其水平上调，可引发血管平滑肌细胞增殖、凋亡紊乱，加重血管损伤。本研究对比2组血清miR-145水平可知，血清miR-145水平在AIS患者中出现异常高表达状态，并随神经缺损严重程度呈升高趋势，充分说明血清miR-145表达水平上调，可调控CD40L表达，释放大量血管内炎症因子，加重血管炎症反应，进而在AIS发生、发展中起促进作用，且miR-145水平高表达还能降低超氧化物歧化酶活性，参与脑缺血再灌注损伤的氧化应激过程，加重神经功能损伤程度。ROC曲线分析进一步证明，血清miR-145诊断AIS的AUC(0.791)>miR-124(0.717)，且当截断值为7.25时，特异度高达90.24%，说明miR-145有望成为诊断AIS的特异性生物标志物，为临床早期AIS诊治提供新思路、新方向。另外，有学者指出，在缺氧条件下，miR-145表达下调是导致平滑肌细胞过度增殖、迁移，加重血管损伤后再狭窄程度，促进血管狭窄发生发展的重要因素之一。通过RT-PCR法检测不同CAS斑块性质患者可知，易损斑块患者血清miR-145水平明显高于稳定斑块患者，提示miR-145可能是识别CAS斑块性质的潜在标志物，故可通过调节血清miR-145水平，防止CAS斑块破裂，促进AIS病情转归。

血清miR-124、miR-145作为诊断AIS的潜在特异性生物标志物，与神经功能缺损程度、CAS斑块性质存在一定相关性，在AIS患者治疗过程中可通过调节血清miR-124、miR-145表达，发挥保护神经功能、抑制CAS斑块病变进展的作用。