色素上皮衍生因子及其基因多态性与脑微出血的关系

王 楠 郭 霞 武俊平 贾 璐 雍 雯 刘 颖 肖庆博 刘美玉 吴丽娥

包头医学院第一附属医院神经内二科，内蒙古 包头 014010

脑微出血(cerebral microbleeds，CMBs)是指脑小血管壁损害，血液从血管壁渗出形成含铁血黄素，在脑实质沉积为主要特征的亚临床性脑实质损害[1]。由于其出血量少，临床上无明显症状和体征，因此，目前诊断主要依靠影像学。随着科学技术的进步，目前研究发现，脑微出血的发生是导致脑出血、缺血性脑卒中、死亡和痴呆发病的高危因素[2]。色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是一种视网膜色素上皮细胞分泌的蛋白，具有多种生物学功能，且其启动子区的单核苷酸多态位点(SNP)可能通过影响基因转录活性而改变蛋白的表达。研究显示，PEDF可能与黄斑变性、糖尿病微血管病变、慢性肾病微血管病变等存在相关性[3]。目前关于PEDF及其基因多态性与脑微出血的相关性研究尚无报道，本研究探讨血清PEDF及其基因启动子区rs12948385的多态性与脑微出血的关系，旨在为脑微出血的防治提供新的依据。

1 资料与方法

1．1 研究对象 纳入2017-12—2019-09包头医学院第一附属医院神经内二科收治的CMBs患者55例为病例组，同期55例健康体检者为对照组。CMBs诊断标准：根据2015年《中国脑小血管病诊治专家共识》[4]，磁共振SWI序列上圆形或卵圆形、质地均一，直径2～5 mm且周围无水肿的低信号病灶，并除外颅内钙化。纳入标准：(1)年龄>18岁；(2)完成常规MR和SWI检查确诊为CMBs的入院患者。排除标准：(1)经头部MRI或CT证实有动静脉畸形、海绵状血管瘤、毛细血管扩张症、急性脑梗死及脑肿瘤患者；(2)影像学疑似多发性硬化、视神经脊髓炎、进行性多灶性白质脑病等白质变性疾病；(3)有明确脑外伤史；(4)合并严重心、肺、肝、肾衰竭，严重感染、自身免疫性疾病；(5)有心脏起搏器、恶性肿瘤者，有血液系统、糖尿病微血管疾病者。

1．2 方法 患者入院后，完成SWI检查(图1)。登记患者一般资料和既往史，第2天空腹抽血，完成血常规、生化、凝血、血糖、尿酸等相关检查。采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清PEDF浓度(江苏酶免公司)。使用基因组DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司)提取全血DNA，采用聚合酶链式反应-限制性核酸内切酶片段长度多态性法(PCR-RFLP)进行PEDF-rs12948385基因分型用Prime5.0设计引物，由博迈德生物技术有限公司合成。上游引物为5’-CTACAGGTGCGCGCCAAC-3’，下游引物为5’-CTAAGGCGCACACATTTGCACA-3’。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；最后72 ℃延伸5 min。将PCR产物用限制性内切酶HincⅡ 37 ℃水浴20 min消化。根据酶切后出现片段的大小得出rs12948385的基因分型结果：GG：351 bp；AA：280 bp、71 bp；GA：351 bp、280 bp、71bp。

2 结果

2．1 2组一般资料及PEDF浓度比较 CMBs组与健康对照组血小板计数和低密度胆固醇比较差异无统计学意义(P>0.05)，2组年龄、空腹血糖、同型半胱氨酸、血清PEDF浓度比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组一般资料比较Table 1 Comparison of general information of two groups

注：PLT：血小板；LDL-C：低密度脂蛋白；Hcy：同型半胱氨酸；PEDF：色素上皮衍生因子

图1 头颅SWI示双侧大脑皮质多个直径2～5 mm的微出血灶(如箭头所示)Figure 1 SWI of the skull shows multiple microbleeds with diameters of 2 to 5 mm on both sides of the cerebral cortex (showing by the arrows)

2．2 Logistic 回归分析 将CMBs作为因变量，以年龄、空腹血糖、Hcy、血PEDF作为自变量，做多因素非条件Logistic回归分析，结果显示，血PEDF、年龄与CMBs明显相关(血PEDF，OR=0.980，95%CI0.962～0.998，P<0.05；年龄OR=1.070，95%CI1.000～1.144，P<0.05)。

2．3 基因型分析 PEDF-rs12948385位点的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。2组PEDF-rs12948385的基因型(GG、GA、AA)和等位基因(G/A)的分布差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。由于AA基因型出现频率小，将AA与GA基因型合并，校正年龄、性别、空腹血糖后与GG基因型相比，AA+GA基因型增加脑微出血的发病风险是GG组的6.443倍(OR=6.443，95%CI=1.082～38.351)。

表2 2组基因型与等位基因的分布频率比较 [n(%)]Table 2 Comparison of the distribution frequencies of genotypesand alleles of the two groups [n(%)]

3 讨论

PEDF是一种多功能蛋白，与多种微血管疾病的发生密切相关，但其相关研究大多局限于视网膜病变、糖尿病微血管病变和肿瘤等疾病。在2005年的一项动物实验中发现，在1型糖尿病大鼠肾脏的肾小球和肾小管上皮细胞、间质组织中PEDF及mRNA的表达均显著降低[5]，但2014年一篇报道通过对2型糖尿病患者平均4 a的随访观察发现，2型糖尿病肾病患者血清PEDF水平可代偿性升高[6]。但对于PEDF的作用机制还不甚明确，相关学者认为PEDF通过减少新生血管生成，保护血管内皮细胞完整性减少蛋白尿漏出[7]。CMBs是一种常见的脑小血管病，与糖尿病肾病同属于微小血管疾病，同时，脑和肾脏的小血管系统在整个心动周期中均暴露在高血流、高压力的血流冲击下，属于应变血管，具有相似的血管调控机制和解剖结构[8]，因此推测PEDF与CMBs的发生同样密切相关。

本研究显示，CMBs组PEDF血清浓度低于健康对照组，且进一步多因素非条件Logistic回归因分析显示，血PEDF水平是发生CMBs的独立危险因素。众所周知，PEDF具有抗炎和抗氧化作用[9]，抑制内皮功能障碍的发生发展，相关研究认为内皮功能障碍可能是CMBs发生的始动环节，是脑小血管病的根本[10]，因此推测PEDF可能通过抑制内皮功能障碍的发生从而抑制CMBs的发生，由于PEDF的降低导致内皮功能障碍的抑制作用降低导致微出血的发生。

本研究提示，2组间年龄、空腹血糖、同型半胱氨酸、血清PEDF浓度比较差异有统计学意义(P<0.05)。目前，相关研究认为，血同型半胱氨酸与脑小血管病的发生密切相关[11]，本研究中单因素分析显示其在CMBs组与健康对照组间差异有统计学意义(P<0.05)，但多因素非条件Logistic回归因分析显示血同型半胱氨酸并不是CMBs发生的独立危险因素。

在PEDF基因多态性的相关研究中，有学者发现，PEDF-rs12948385与视网膜微小血管相关[12-13]。而CMBs同属于微小血管疾病，目前关于CMBs与PEDF-rs12948385d的相关性目前尚无报道。rs12948385是PEDF基因转录起始点上游358 bp处存在的G→A突变，CMBs组携带A基因的频率高于健康对照组。在校正年龄、性别及空腹血糖后，与GG基因型相比，GA+AA基因型发生CMBs的风险高，且GA+AA基因型发生CMBs的风险是GG型基因的6.271倍。

血PEDF浓度及其启动子区基因多态性与脑微出血的发生可能存在相关性，但本研究为单中心研究，样本量相对有限，易产生测量偏倚，且目前关于PEDF与CMBs的相关研究尚无相关报道，我们的研究需要进一步验证。