大蒜素抑制成纤维细胞增殖及迁移

朱守雷，杨建东，蔡俊，张玉杰，田原

（扬州大学临床医学院/苏北人民医院 脊柱科，江苏 扬州）

0 引言

腰椎硬膜外纤维化又称为硬膜外瘢痕，多项研究已证实成纤维细胞增殖引起硬膜外瘢痕过度增生，最终造成椎板切除术后硬膜囊及神经根受压而产生腰腿痛症状[1]。在预防硬膜外纤维化方面，国内外学者采用了许多方法，包括微创手术、药物治疗、新兴生物材料等[2]，最近一些学者使用免疫抑制剂及抗肿瘤药物来抑制成纤维细胞增殖从而预防硬膜外纤维化[3]。然而这些药物具有不同程度的毒副作用，因此寻找一种能够预防硬膜外纤维化且无明显毒副作用的药物具有重要的临床意义。

大蒜素是一类含硫天然化合物，是大蒜的主要活性物质，化学名为烯丙基硫代亚磺酯丙酯，具有消炎、抗菌、降血糖、降血脂及抗癌等多种生物活性，而且有抗心脏、肝脏以及肺等器官组织纤维化作用，而对正常组织细胞毒性作用很小[4]。然而大蒜素是否具有预防硬膜外纤维化的作用却鲜有报道，因此本实验假设大蒜素可抑制硬膜外瘢痕来源的成纤维细胞增殖及迁移，为预防硬膜外瘢痕提供新思路。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

大蒜素购自中国青岛捷世康生物科技有限公司，人体硬膜外瘢痕来源的成纤维细胞购自中国科学院上海细胞典藏库，DMEM 培养液、胎牛血清购自美国Gibco 公司，青霉素链霉素混合液、胰酶消化液购自中国碧云天生物科技研究所，PBS 购自美国Hyclone 公司，CCK-8 试剂盒购自日本Dojindo Laboratories 公司，AO/EB 试剂盒购自中国南京凯基生物科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

在含有10% 胎牛血清、100 mg/L 链霉素和1×105U/L青霉素的DMEM 培养液并于37 ℃、5% CO2及饱和湿度下孵箱中培养成纤维细胞，隔日换液。

1.2.2 CCK-8 检测细胞活力

待细胞生长至对数生长期，0.25%胰酶消化细胞，以细胞密度为1×105/mL 的成纤维细胞悬液接种于96 孔板，培养24 h 后分别加入浓度为0、12.5、25、50、100、200 和400 mg/L的大蒜素再培养24 h，加入CCK-8 试剂10 μL，在450 nm波长下测定OD 值。细胞存活率=（实验孔OD 值- 空白孔OD 值）/（对照孔OD 值- 空白孔OD 值）×100%。绘制细胞存活率曲线，并计算药物半数抑制率IC50 值。

1.2.3 倒置相差显微镜、荧光显微镜下观察细胞形态

待细胞生长至对数生长期，根据1.2.2 研究结果，分别加入终浓度为0、25、50、100 mg/L 的大蒜素，培养24 h 后，显微镜下观察细胞形态。用浓度为0.5 μg/μL 的AO/EB 染色液4 μL 加入到预观察的细胞悬液100 μL 中，取10 μL 于载玻片上，在荧光显微镜下观察。

1.2.4 划痕试验检测细胞迁移能力

将成纤维细胞按2×105/mL 铺板于6 孔板中，细胞培养24 h 后用黄色吸头于每孔沿线垂直划3 道划痕，PBS 清洗掉划落的细胞，每孔依次加入大蒜素浓度分别为0、25、50、100 mg/L 无血清培养液2 mL，分别于0 h 及24 h 观察拍照。用ImageJ 1.46 软件计算迁移率。迁移率=（初始面积- 相应时间点的面积）/初始面积×100%。

1.2.5 统计学分析

数据通过SPSS 19.0 统计学软件分析处理后，数据以均数±标准差）来表示，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK 法，均以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大蒜素对细胞活力的影响

不同浓度大蒜素处理成纤维细胞后，细胞活性被明显抑制，随着药物浓度的增加，细胞的存活率也逐渐下降（表1、图1），与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），IC50 值为57.35 mg/L。

表1 CCK-8 法检测不同浓度大蒜素处理后细胞的存活率

表1 CCK-8 法检测不同浓度大蒜素处理后细胞的存活率

注：*P＜0.05，与对照组比较。

组别 n OD 值 存活率对照组 6 0.970±0.028 1.000 12.5 mg/L 6 0.805±0.010 0.787±0.013*25 mg/L 6 0.714±0.021 0.670±0.027*50 mg/L 6 0.610±0.032 0.536±0.041*100 mg/L 6 0.508±0.020 0.405±0.025*200 mg/L 6 0.392±0.020 0.256±0.025*400 mg/L 6 0.268±0.032 0.096±0.041*

图1 大蒜素对成纤维细胞活力的影响

2.2 大蒜素对成纤维细胞形态结构的影响

2.2.1 倒置相差显微镜观察不同浓度大蒜素对成纤维细胞形态的影响

不同浓度大蒜素作用于成纤维细胞24 h 后，镜下见对照组细胞呈梭形，大小均匀，轮廓清晰，核仁呈椭圆形，贴壁生长。随着大蒜素浓度的增加，细胞体积变小，形态不规则，核固缩，呈现凋亡特征（图2）。

图2 倒置相差显微镜下不同浓度大蒜素作用于成纤维细胞24 h 后细胞形态观察（100×）

2.2.2 荧光显微镜下观察不同浓度大蒜素对成纤维细胞形态的影响

不同浓度大蒜素作用于成纤维细胞24 h 后，对照组细胞结构清晰，包膜完整，着均匀的绿色荧光。随着药物浓度增大，活细胞比例逐渐减少，部分细胞核染色质着橘红色，并出现凋亡小体（图3）。

图3 荧光显微镜下（200×）不同浓度大蒜素作用于成纤维细胞24 h后AO/EB 染色

2.3 大蒜素对成纤维细胞迁移能力的影响

用0、25、50、100 mg/L 大 蒜 素 处 理 成 纤 维 细 胞，0 h 及24 h 细胞划痕结果见图4。细胞迁移率分别为（51.93±3.53）%、（40.68±2.05）%、（27.82±1.54）% 及（13.63±1.27）%。与对照组比较，随着大蒜素浓度增加，细胞迁移率逐渐下降，差异有统计学意义（n=3，P＜0.05），见图5。

图4 不同浓度大蒜素对成纤维细胞的细胞划痕试验比较（40×）

图5 不同浓度大蒜素处理成纤维细胞24 h 后细胞迁移率比较

3 讨论

硬膜外瘢痕的形成是一个比较复杂的病理生理过程，实质是纤维结缔组织增生来修复椎板切除造成的局部缺损，目前公认的硬膜外纤维化学说认为纤维环、后纵韧带及腰骶区的过度纤维疤痕形成，是椎板和椎间盘切除术后腰腿痛的主要原因[5]。近年来微创手术技术虽然在不断进步，但是椎板切除术后硬膜外瘢痕造成的手术效果不满意仍然是困扰外 科医师的一大难题。也有许多学者通过使用各种新兴生物材料作为物理屏障来预防瘢痕对硬膜囊及神经根的挤压，但这些置入的材料不仅本身就有可能对硬膜囊及神经根造成挤压，而且有些材料不能被人体吸收，对异物可产生机械刺激[6]。随着对硬膜外瘢痕的深入研究，一些学者通过动物体内外实验发现抑制瘢痕中的成纤维细胞增殖、调节胶原代谢可有效预防硬膜外纤维化[7]。当前预防硬膜外瘢痕的药物种类繁多，但这些药物大部分具有不同程度的毒副作用而限制了在临床上的广泛使用。这促使我们探寻新的能抑制成纤维细胞过度增殖的药物，以预防硬膜外瘢痕过度增生。

大蒜素发挥生物活性作用的主要成分为二烯丙三硫，具有促健康和低毒性的特点[4]。吴更等[8]发现大蒜素能浓度依赖性抑制人牙周膜成纤维细胞的增殖和蛋白合成来治疗根尖周病；李少春[9]发现大蒜素能抑制心肌成纤维细胞增殖分化来预防心肌梗死后纤维化。但关于大蒜素在硬膜外瘢痕中的研究及应用甚少，本实验通过选择不同浓度的大蒜素处理成纤维细胞，探讨大蒜素是否具有抑制成纤维细胞增殖及迁移的作用，为大蒜素预防硬膜外瘢痕提供理论依据。

本研究中，CCK-8 试验结果发现不同浓度大蒜素处理细胞后，与对照组比较，实验组OD 值明显降低，并呈一定的药物浓度依赖性（P＜0.05），这说明大蒜素能够抑制成纤维细胞增殖。显微镜下，对照组细胞体积大小均匀呈梭形，轮廓清晰，细胞核呈规则的椭圆形；加入不同浓度大蒜素后，细胞体积变小，形态不规则，核仁收缩，部分细胞轮廓模糊或消失，随着大蒜素浓度增加部分细胞呈点状，不能贴壁生长。荧光显微镜下发现，随着大蒜素浓度增加，部分细胞膜皱缩，胞浆减少，核固缩，出现凋亡小体等凋亡特征，且死细胞数量逐渐增多。划痕试验结果发现，与对照组比较，随着大蒜素浓度的增加成纤维细胞迁移率逐渐降低（P＜0.05），说明大蒜素能有效抑制成纤维细胞迁移。

综上所述，大蒜素具有抑制成纤维细胞增殖及迁移的作用。后期我们将进一步探讨其分子生物学机制，为预防硬膜外瘢痕提供了理论基础。