虾蛄可食组织中镉和砷的形态及分布特征

赵艳芳，康绪明，宁劲松，翟毓秀，尚德荣,*，丁海燕，盛晓风

（1.中国水产科学研究院黄海水产研究所，农业农村部水产品质量安全检测与评价重点实验室，山东 青岛 266071；2.农业农村部水产品质量安全风险评估实验室，山东 青岛 266071）

虾蛄（Oratosquilla oratoria），俗名琵琶虾、皮皮虾，隶属甲壳纲、口足目、虾蛄科，主要生活在近海浅滩、泥质海底的巢穴之中，全国各地沿海均有分布，也是出口创汇的重要水产品之一。随着海洋捕捞鱼类资源的严重衰退，虾蛄已成为一些海域渔获量最高的种类之一[1-3]。虾蛄风味独特，营养丰富，富含蛋白质、磷、微量元素以及人体必需的氨基酸。虾蛄提取物对人鼻咽癌细胞、人肝癌细胞具有一定的抑制作用，可作为一类新型、天然的抗肿瘤药物[4-7]。近年来随着人们膳食结构的转变，虾蛄已成为深受人们喜爱的佳肴。

沿海水域重金属污染直接影响水产品中重金属的含量。镉是一种生物体非必需的有毒重金属，被美国毒物管理委员会列为第6位危害人体健康的有毒物质。对国内外沿海水域经济水产品的重金属污染情况调查发现贝类、甲壳类中重金属的含量远高于鱼类[8-10]。对虾蛄的质量安全研究发现，虾蛄可食组织中镉的含量较高，超标非常严重[11-12]。镉等有害元素成为影响虾蛄食用安全的关键因素，近几年，诸多有关虾蛄“镉污染”的新闻、媒体负面报道也给消费者与生产者带来不良的经济和社会影响。砷是一种有毒有害的非金属元素，广泛存在于自然界中。海产品中含有大量不同形态的砷[13-14]，人们在食用含砷的海产品时，砷在人体内易发生富集对人体的生命健康造成一定威胁。世界卫生组织和美国环保局将砷定级为“已知的人类致癌物质”[15]。由于水生生物对镉、砷等有害元素的强富集性，使得原本提供丰富优质蛋白质等营养成分的水产品成为有毒有害元素进入人体的桥梁。

镉、砷的毒性与它的化学形态有关，因此，对虾蛄中镉、砷的检测与食用安全评估不能仅以有害元素的总量作为评价标准。虾蛄可食组织主要包括性腺和肌肉，尤其是性成熟时期的虾蛄产品更受消费者青睐，但截至目前针对可食组织中镉、砷的分布特征及其形态研究较少，因此，本研究拟运用微波消解-电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICPMS）技术以及高效液相色谱-ICP-MS（high performance liquid chromatography-ICP-MS，HPLC-ICP-MS）联用技术分析测定虾蛄可食组织中镉、砷的分布特征及其形态，以期为虾蛄中镉、砷的食用安全评估提供一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

性成熟的海捕野生虾蛄于2018年5月随机采集于山东青岛沿海主要码头（2 份雄性，3 份雌性）和辽宁大连水产品批发市场（4 份雄性，2 份雌性），每份样品约1 000 g。

草酸、无水氢氧化锂、无水乙酸钠、硝酸钾、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠（均为优级纯） 国药集团化学试剂有限公司；浓硝酸（优级纯） 上海泰坦科技股份有限公司。

砷酸根标准溶液（As（III），GBW 08666）、亚砷酸根标准溶液（As（V），GBW 08667）、砷甜菜碱标准溶液（AsB，GBW 08670）、一甲基砷标准溶液（monomethylarsonic acid，MMA，GBW 08668）、二甲基砷标准溶液（dimethylarsinic acid，DMA，GBW 08669）、无机镉离子标准溶液（Cd2＋，GBW 08612）国家标准物质中心。

1.2 仪器与设备

Elan DRC II ICP-MS仪、HPLC-ICP-MS联用仪 美国Perkin Elmer公司；Mars 6密闭微波消解仪 美国CEM公司；MS3旋涡混匀仪 德国IKA公司；Neofuge 15台式高速离心机 力康生物医疗科技控股有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

虾蛄样品去壳和头后，取出可食用组织，包括性腺（雌和雄）和肌肉，分别匀浆后待用。

1.3.2 虾蛄可食组织中无机态镉离子的测定

虾蛄可食组织中无机镉的测定采用HPLC-ICP-MS方法[16]，液相色谱分离选用Dionex IonPac CS5A（4 mm×250 mm）阳离子交换色谱柱及保护柱CG5A（4 mm×50 mm）；流动相组成为50 mmol/L草酸、95 mmol/L氢氧化锂（pH 4.8）溶液，使用前经过0.45 μm滤膜过滤并超声脱气15 min。称取1.000 g虾蛄可食组织置于50 mL塑料刻度离心管中，加入15 mL浸提液，浸提液组成为10 mmol/L Tris缓冲溶液与0.1 mol/L NaCl混合液（pH 7.5），均质机混匀后，超声提取40 min，8 000 r/min离心10 min，取出上清液用0.45 μm的水系微孔滤膜过滤，移入进样瓶中，上机测定无机镉离子的值。

1.3.3 虾蛄可食组织中砷的形态分析

参考GB/T 23372—2009《食品中无机砷的测定 液相色谱-电感耦合等离子体质谱法》[17]，采用HPLCICP-MS联用技术。液相色谱柱为阴离子保护柱IonPac AG 19（50 mm×4 mm）和阴离子分析柱IonPac AS 19（250 mm×4 mm）；流动相：A相组成为10 mmol/L无水乙酸钠、3 mmol/L硝酸钾、2 mmol/L磷酸二氢钠，0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二钠、4%氢氧化钠调pH 10.7溶液，B相组成为无水乙醇，A-B（9∶1，V/V）。取虾蛄可食组织约1.000 g，加入15 mL超纯水，涡旋混匀后，超声提取40 min，以8 000 r/min转速离心10 min后，吸取上清液过0.45 μm滤膜，滤液注入HPLC-ICP-MS联用仪对AsB、As（III）、As（V）、MMA和DMA不同形态的砷进行定性和定量分析。

1.3.4 虾蛄可食组织中总镉和总砷含量检测

样品中总镉和总砷的含量采用ICP-MS测定。准确称取1.000 g样品于微波消解罐中，加入8 mL浓HNO3浸泡24 h后，采用微波消解仪进行消解和赶酸，程序见表1。冷却至室温后，用超纯水定容至25 mL，混匀备测，同时做空白实验。

表 1 微波消解程序Table 1 Microwave digestion procedures

采用ICP-MS测定消化液中总镉和总砷的含量，测定过程中在线加入10 ng/mL103Rh为内标元素用于校正仪器响应信号的变化。ICP-MS仪器条件：射频功率1 500 W、射频电压1.20 V、等离子体气流量15 L/min、载气流量0.92 L/min、重复3 次。以待测元素质量浓度为横坐标，待测元素与103Rh响应信号值的比值为纵坐标，绘制标准曲线。选择生物成分分析标准物质大虾GBW1050和扇贝GBW10024为质控样品保证镉和砷检测的准确性。

1.4 数据统计与分析

结果用 ±s表示，采用SPSS 13.0进行相关性分析，P＜0.05，差异显著，采用Sigma Plot 12.5作图。

2 结果与分析

2.1 虾蛄可食组织中总镉及无机镉的分布特征

表 2 质控标准物质中总镉含量（n=3）Table 2 Total cadmium concentration in certified reference materials (n= 3)

表 3 虾蛄可食组织中总镉和无机镉的含量（n=3）Table 3 Contents of total cadmium and inorganic Cd2+ in the edible tissues of O. oratoria (n= 3)

采用本实验方法测定质控标准物质大虾GBW1050和扇贝GBW10024中镉的含量见表2，2 种标准物质的实测值均在标准值范围内，且相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）均较低，说明本方法测定样品中镉的含量准确度高、精密度好。

分别对雌、雄虾蛄肌肉与性腺组织中的总镉含量进行分析可见，虾蛄可食组织中总镉的含量较高，且性腺中总镉的含量远高于肌肉组织（表3）。样品性腺中镉最高含量为44.2 mg/kg，约为肌肉组织的10 倍。肌肉组织中镉的最低含量为1.62 mg/kg，远超出现行国家标准限量值（0.5 mg/kg）的范围。另外，研究表明总镉含量与虾蛄的雌雄性别无明显相关关系。

图 1 HPLC-ICP-MS分析虾蛄可食组织中无机镉离子谱图Fig. 1 Chromatograms of Cd2+ in muscle and gonad of O. oratoria using HPLC-ICP-MS

从图1可见，性腺中无机镉离子含量远高于肌肉组织。对所有样品中无机镉离子含量进行测定发现（表3），大部分样品无机离子态镉占总镉百分比的20%以下，相关性分析发现所有组织中无机镉含量与总镉含量之间呈显著正相关关系（P＜0.001），即总镉含量越高的样品或组织中其无机镉含量也较高。所有肌肉组织中无机镉含量均远低于1.0 mg/kg，11 份样品中，有7 份样品肌肉组织中无机镉含量低于0.50 mg/kg，而性腺中无机镉含量较高，均超出1.0 mg/kg。

2.2 虾蛄不同组织中总砷及砷形态的含量分布特征

表 4 质控标准物质中总砷含量（n=3）Table 4 Total arsenic concentration in certified reference materials (n= 3)

质控标准物质大虾GBW1050和扇贝GBW10024中总砷的含量分析见表4，标准物质的实测值在标准值范围内，且RSD较低，说明本研究采用的ICP-MS法测定水产品中总砷的含量准确度高、精密度好，适合于虾蛄中总砷的测定。

对虾蛄不同组织中总砷及4 种主要有毒砷形态的含量分析见表5。虾蛄中总砷含量较高，且性腺中总砷含量普遍高于肌肉组织，但与雌雄性别无明显相关关系。

表 5 虾蛄可食组织中总砷和4 种主要砷形态含量（n=3）Table 5 Concentrations of total arsenic and four arsenic species in muscle and gonad of O. oratoria (n= 3) mg/kg

图 2 HPLC-ICP-MS砷形态分析谱图Fig. 2 Chromatograms of different arsenic species in muscle and gonad of O. oratoria using HPLC-ICP-MS

采用HPLC-ICP-MS联用技术可以很好地分离虾蛄组织中As的5 种不同形态（图2）。对虾蛄不同组织中砷形态进行分析可见，所有虾蛄样品中均检出As（III）和As（V），其中肌肉组织中无机砷的含量最高，为0.46 mg/kg，性腺中无机砷的含量最高，为1.04 mg/kg。相关性分析得出所有样品各可食组织中无机砷的含量与总砷之间无显著相关关系（P＞0.05）。肌肉组织中无机砷占总砷百分比非常低，范围为1.71%～6.14%。除无机砷外，还从部分样品中检出少量的MMA和DMA。有机砷形态AsB是虾蛄所有可食组织中的主要砷形态，其占总砷的75.0%～95.7%，平均值为88.1%。

3 讨 论

水生生物极易富集环境中的镉，如贝类可富集105～106倍，且镉可沿食物链转移蓄积[18]，本研究结果表明虾蛄对镉具有较强的富集能力。虾蛄中镉的含量较高已有报道[12]，但针对可食组织中镉的分布特征鲜见报道。本研究通过分析可食组织中镉的分布特征，发现肌肉组织中镉的含量远低于可食的性腺组织，但是按照现行GB 2762—2017《食品中污染物限量》中针对甲壳类中镉的限量要求为0.5 mg/kg，在本实验中采集的虾蛄样品肌肉组织中镉的超标率为100%。镉离子进入生物体内可以与蛋白质、有机酸等结合成比较稳定的有机镉形态存在，只有少部分的镉在体内以无机离子态存在[19]。研究表明与蛋白结合的镉（即有机态镉）对细胞毒性明显低于无机离子态的镉[20]，因此若简单地仅分析镉的总含量，并以其离子态的毒性效应作为评价标准会高估其毒害效应。课题组在前期运用体积排阻色谱-HPLC-ICP-MS分析了虾蛄肌肉组织中镉的有机形态主要以镉-金属硫蛋白形态存在[21]，本研究在此基础上，进一步采用HPLCICP-MS技术分析可食肌肉组织与性腺组织中无机离子态镉的含量，该方法采用中性盐缓冲体系为浸提液，能够最大可能保持虾蛄组织中镉的原始形态不变，通过阳离子交换色谱柱的吸附洗脱完成对无机离子态镉的分离和测定[16]，分析结果表明肌肉组织与性腺组织中无机离子态镉的含量较低，且无机离子态镉占总镉的质量百分数较低，进一步表明镉主要以有机形态存在于虾蛄可食组织中。

本研究表明按照GB 2762—2017《食品中污染物限量》中甲壳类重金属镉的限量要求，虾蛄可食组织中镉的超标情况比较严重。截止目前，关于甲壳类中重金属镉的安全限量值，不同国家有自己不同的标准，如欧盟限定甲壳类动物镉限量值为0.5 mg/kg，美国限定甲壳类中镉限量值为3.0 mg/kg，韩国限量值为2.0 mg/kg[22]，由此可见，我国的标准限量值相对比较严格。针对虾蛄这种具有高富集镉特性的甲壳类品种，开展镉的标准限量再评价，制定一个更为科学合理的标准限量值更具意义。本研究结果证明了虾蛄可食组织中毒性最高的无机离子态镉含量较低，下一步的重点工作应在镉形态分析的研究基础上，聚焦镉的生物利用率即探究虾蛄中镉的内暴露剂量（被机体摄入后经过消化、吸收而达到组织产生毒性作用的剂量），因为基于污染物内暴露剂量进行的膳食暴露评估结果制定的限量标准值才更科学、更合理[23]。

鱼类、甲壳类和贝类等水产品是人类膳食优质蛋白质的来源之一，同时也是人体摄入砷的一种重要来源，研究表明人们日常饮食中约90%的砷来自于水产品[24]。本研究发现虾蛄可食组织中总砷含量较高，肌肉组织与性腺中总砷的含量分别与已报道的具有较强砷富集能力的三疣梭子蟹肌肉与性腺中的含量相近[25]，说明虾蛄对砷具有较高的富集能力。砷的形态分析表明虾蛄可食组织中含有多种不同形态的砷。国际癌症研究中心确认无机砷及其化合物为I级致癌物质，MMA和DMA被归为潜在的致癌物质[26]。As（III）是毒性最强的砷化合物，进入人体后，能与人体内带巯基的酶蛋白结合，干扰细胞的生物功能、结构和正常代谢，产生毒性效应，As（V）主要是取代磷酸，竞争磷酸化偶联而产生毒性，DMA和MMA在酶的作用下会脱去甲基形成自由基，促使脂质氧化，损害膜细胞[27]。虾蛄可食组织中无机砷的检出率较高，在所采集的样品中，肌肉组织中无机砷的检出率为100%，但是其含量均未超出国家标准GB 2762—2017中无机砷的限量要求（0.5 mg/kg），且无机砷占总砷的百分含量非常低。虽然有一个样品的性腺组织中无机砷的含量超出了限量要求，但是由于性腺占可食部分的质量百分比非常低，因此对虾蛄可食组织的无机砷风险影响极低。另外，在可食组织中也检出了低量的DMA和MMA，且其分布没有明显的雌雄差异和组织差异。虽然虾蛄可食组织中存在一定量的无机砷、DMA和MMA，但是通过图2也可见，大分子的有机砷化合物（AsB）是虾蛄可食组织中主要的砷形态。DMA是海洋生物中最主要的甲基砷化合物，而MMA含量较少，AsB是海洋生物中最主要的水溶性砷形态[28]。研究表明AsB化学性质稳定、无毒。在人体和其他哺乳动物中未发生转化便被排泄出体外，体外细胞实验证明AsB不能使哺乳动物细胞发生诱导突变，无细胞毒性、免疫毒性和生殖毒性，常被视为无毒的有机砷形态[29]，因此考察虾蛄中砷含量危害时，应该考虑砷存在形态问题。