菜肴中3-氯-1,2-丙二醇及其酯的含量分析

张璟琳，刘廷竹，黄明泉,*，孙宝国

（1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.北京工商大学 食品质量与安全北京实验室，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048）

3-氯-1,2-丙二醇（3-monochloro-1,2-propanediol，3-MCPD）于1978年的食品加工中的酸水解植物蛋白中被发现[1]，之后又在多种食品中检测到。2004年，3-MCPD及其酯类在多种精炼油脂中被发现[2]。因为3-氯-1,2-丙二醇酯（3-MCPD酯）含量超出3-MCPD几十倍，所以随后3-MCPD酯的研究引起了广泛关注。研究表明3-MCPD酯可被肠道吸收，从而产生毒性[3]，除此3-MCPD酯本身也具有毒性，有研究指出3-MCPD酯类化合物对肾脏和睾丸具有毒性[4-5]，同时对大脑和潜在的神经系统具有毒性[6-7]。然而在食品中3-MCPD酯含量远高于3-MCPD[8]，所以客观评价3-MCPD酯对消费者潜在的健康危害风险非常重要。目前我国仅对3-MCPD在调味品中的含量进行了限量，在固态调味品中低于1 mg/kg，在液态调味品中低于0.02 mg/kg[9]联合国粮食与农业组织/世界卫生组织联合食品添加剂专家委员会提出的暂定每日最大耐受摄入量（provisional maximum tolerable daily intake，PMTDI）为2 μg/（kg·d）[10]。

为测定食品中3-MCPD酯的含量，很多研究者对其检测方法进行优化。3-MCPD酯的检测方法主要分为直接法和间接法。目前多采用间接法，间接法一般分为以下几步[11]：样品中添加内标物，酯交换（通常在酸性[12-13]或碱性[14]条件下进行），中和混合液并盐析，衍生化反应后进入气相色谱-串联质谱（gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS）联用仪分析。直接法是将样品除杂富集后直接用液相色谱-串联质谱联用仪[15]、液相色谱-飞行时间质谱[15]分析。Dubois等[16]将直接法和间接法进行了对比，发现2 种方法定量结果无显著差异，但是间接法需要的标准品更少，且适用于不同类型的植物油，所以常规检测更推荐利用间接法。Hrncirik等[17]对不同酯交换条件进行探索，3-MCPD在碱性条件下3-MCPD不稳定[18]，而在酸性条件较稳定[19]。

对于食品中3-MCPD及3-MCPD酯的含量多有报道[20]，Vicente等[21]检测了232 种样品，发现酱油中3-MCPD含量较高，为4 405 μg/kg，面包（716 μg/kg）、烟熏食品（49 μg/kg）中含量较低。Becalski等[22]对加拿大市场食品中氯丙醇酯含量调查发现，核桃、米糠、葡萄籽油和棕榈油中的含量较高。Ilko等[23]分析了炸薯条中3-MCPD酯含量为654～1 920 μg/kg。韩枫[24]检测了125 份植物油，其中棕榈油中3-MCPD酯与2-MCPD酯含量普遍较高，含量范围分别2.23～3.16 mg/kg和1.32～1.99 mg/kg。里南[25]对我国的食用油、方便面、油炸食品进行检测，结果表明油炸食品中氯丙醇酯的污染较为严重，3-MCPD酯和2-MCPD酯含量为0.064～7.67 mg/kg和0.072～5.02 mg/kg。

目前对于菜肴中3-MCPD酯含量的研究还鲜见报道。本实验对我国菜肴中的3-MCPD酯含量进行分析，将有助于了解我国饮食中3-MCPD酯的污染程度，为制定我国饮食中3-MCPD酯的最大每日耐受摄入量提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

豆芽炒肉、蒜苔炒肉、菠菜炒鸡蛋、炒土豆片、酱炒土豆片、白菜粉条、清炒圆白菜、清炒冬瓜、西红柿炒鸡蛋、海带炒肉、宫保鸡丁、脆皮豆腐羊肉、清炒花菜 食堂（替代家庭烹调）；农家小炒肉、小炒木耳、青椒炒肉、鱼香肉丝、杏鲍菇炒肉、宫保鸡丁、干煸豆角、炒鸡鸭杂、小炒黄牛肉、炸鸡块、干炸小黄鱼、土豆块炒鱼豆腐、炸土豆条、糖醋里脊、干锅土豆、干锅有机花菜、干锅娃娃菜、干锅圆白菜、红烧茄子、小黄鱼烧豆腐、土豆烧排骨、土豆烧鸡肉、西红柿炖牛腩、大白菜炖豆腐、杏鲍菇炖山鸡 餐馆。

乙醚、正己烷、四氢呋喃、无水硫酸钠（650 ℃灼烧4 h）、碳酸氢钠（均为分析纯），硅藻土（化学纯）国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸（化学纯）北京化工厂；2,2,4-三甲基戊烷、甲醇（均为色谱纯）北京百灵威科技有限公司；七氟丁酰基咪唑（heptafluorobutyrylim idazole，HFBI，分析纯）、3-MCPD（纯度＞98%） 东京化成工业株式会社；D5-3-MCPD 加拿大Toronto Research Chemicals公司；1,2-二棕榈酸氯丙醇酯（1,2-bispalmitoyl-3-chloropropanediol，PP-3-MCPD，99.5%）、D5-1,2-二棕榈酸氯丙醇酯（D5-1,2-bispalmitoyl-3-chloropropanediol，D5-PP-3-MCPD）瑞士Chiron公司。

1.2 仪器与设备

玻璃层析柱（柱长305 mm，内径26 mm） 北京欣维尔玻璃仪器有限公司；QL-901涡旋振荡器 海门市其林贝尔仪器制造公司；精密微量移液器（200、1 000 μL、10 mL） 北京吉尔森科技有限公司；KQ-2500DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；WG9220A电热鼓风干燥箱 天津市通利信达仪器厂；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省予华仪器有限公司；BF-2000氮气吹干仪 北京八方世纪科技有限公司；1 mL气密针 美国Agilent公司；TRACE 1310-TSQ8000 GC-MS/MS仪 美国Thermo Fisher公司；JYL-C012食物打碎机 九阳股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液制备

3-MCPD标准溶液配制：用四氢呋喃稀释至10.00 μg/mL，依次稀释至质量浓度为0.010、0.020、0.050、1.00、2.00、4.00、6.00 μg/mL；PP-3-MCPD标准溶液配制：各采用四氢呋喃分别稀释至2.00、5.00、10.00 μg/mL；D5-PP-3-MCPD及D5-3-MCPD内标溶液配制：各采用四氢呋喃稀释至5.00 μg/mL。

1.3.2 样品制备

1.3.2.1 3-MCPD样品制备

将菜肴于打碎机中打成匀浆，之后准确称取试样4.000 g于100 mL烧杯中，加入6 g饱和氯化钠溶液，加入D5-3-MCPD内标溶液40 μL，超声15 min。

3-MCPD的提取：向小烧杯中加8.00 g硅藻土，玻璃棒搅拌均匀。装入已依次填充少许玻璃棉、2 cm高无水硫酸钠和8.00 g硅藻土的玻璃层析柱中。压实后上层再充填2 cm高无水硫酸钠。静置15 min后，用乙醚150 mL洗脱3-MCPD，洗脱速率约为5 mL/min。250 mL圆底烧瓶收集，收集完成后，向烧瓶中加入25 g无水硫酸钠干燥，过夜。过滤，25 ℃旋转蒸发，最后定容至4.0 mL。

衍生化反应：向4.0 mL试样中加入约2.000 g无水硫酸钠，干燥15 min。移取2.0 mL于5 mL具塞刻度试管中，氮气吹至近干，加入1.0 mL 2,2,4-三甲基戊烷，用气密针立即加入60 μL HFBI，立即密封。涡旋混合后于70 ℃油浴加热20 min。取出后，放置室温，加3.0 mL饱和氯化钠溶液；涡旋振荡30 s，使两相分离。取有机相加无水硫酸钠约为0.300 g干燥。将溶液转移至自动进样的样品瓶中，供GC-MS/MS测定。1.3.2.2 3-MCPD酯样品制备

3-MCPD酯的提取：取试样2.000 g加入到50 mL离心管中，加入内标物D5-PP-3-MCPD溶液40 μL。加入正己烷10 mL，涡旋振荡2 min，超声5 min，离心10 min，将萃取液转入另一个离心管中。相同萃取操作3 次。然后加5 mL蒸馏水，将萃取液中的氯离子洗去，重复3 次。

酯交换反应：将萃取液转移至50 mL圆底烧瓶中，于40 ℃旋转蒸发至约2 mL，转移至放有磁力转子的厚壁耐压管中，氮气吹至接近干，加入2 mL四氢呋喃，加入1.8 mL 0.33 mol/L的硫酸甲醇溶液，并于60 ℃反应12 h。向酯交换反应后的试样中加入0.50 mL饱和碳酸氢钠调制中性，终止反应，然后氮吹，以除去四氢呋喃，加入1.0 mL去离子水，再加入1.0 mL正己烷，重复萃取3 次，以除去酯交换反应生成的脂肪酸甲酯。然后将萃取后的水相转移到100 mL小烧杯中，用1.0 mL乙醚清洗反应管，重复3 次，向小烧杯中加3.0 mL饱和食盐水，以促进3-MCPD在洗脱剂中的溶解。

3-MCPD的提取、衍生化反应与1.3.2.1节方法一致。

1.3.3 仪器分析条件

色谱条件：毛细管色谱柱，Rtx-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；进样口温度260 ℃；载气氦气，恒流模式，流速1 mL/min；进样体积1.0 μL，不分流进样；升温程序，初始50 ℃，以20 ℃/min速率升至90 ℃，再以1 ℃/min升至93 ℃，然后以40 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。

质谱参数：电子电离源，能量为70 eV；传输线温度为280 ℃；离子源温度为280 ℃；碰撞气氩气；多离子反应检测模式。选取m/z为453/169、456/169的离子碎片分别作为3-MCPD衍生物和D5-3-MCPD衍生物的定量离子，其他为辅助定性离子。优化后二级质谱参数如表1所示。

表 1 二级质谱参数Table 1 Parameters of tandem mass spectrometry

1.4 数据处理

内标法计算3-MCPD含量（3-MCPD酯含量以3-MCPD质量计），公式如下：

式中：X为试样中3-MCPD含量/（µg/kg）；C为试样色谱峰峰面积与内标物面积比值在标准曲线上对应3-MCPD的含量/µg；V1为衍生前3-MCPD萃取液的定容体积/mL；V2为衍生时3-MCPD萃取液的取样体积/mL；M为试样的取样量/g。

2 结果与分析

2.1 分析条件的优化

固定酯交换反应温度60 ℃，酯交换反应时间分别为8、10、12、14、16 h。按照实验方法进行净化、衍生、GC-MS/MS测定，结果如图1所示。

图 1 酯交换反应时间对3-MCPD含量结果测定的影响Fig. 1 Effects of reaction time on the content of 3-MCPD esters

从图1可以看出，在酯交换反应时间8～12 h呈上升趋势，在12～16 h峰面积响应值相对比较稳定，所以选择酯交换反应时间12 h、酯交换反应温度60 ℃，作为酯交换反应的较优条件。

酯交换反应结束后，直接进行液液萃取，然后过层析柱，发现每次需要大量的无水硫酸钠才能够除尽水分；而将有机溶剂四氢呋喃吹干后，再进行液液萃取，无水硫酸钠的需求量相对比较小。因为后续衍生实验需要无水条件，所以，选择液液萃取前先将有机溶剂吹干，再进行后期净化衍生等步骤。

图 2 3-MCPD衍生物一级质谱图Fig. 2 Mass spectra of 3-MCPD derivatives

目标分子的一级质谱碎片离子中丰度最高的是质荷比（m/z）为169和69的离子碎片，但是m/z169的离子碎片是[—C3F7]＋、m/z69离子碎片是[CF3]＋，均不是来自氯丙醇，而是HFBI所产生，故不能选m/z169、m/z69离子碎片作为母离子。3-MCPD衍生物所选特征母离子m/z分别为253、275、453；D5-3-MCPD衍生物所选特征母离子m/z分别257、293、456。由于2-MCPD衍生物中也含有253和275离子碎片，而且该离子的二级质谱图也相同，同时在实际样品中2-MCPD和3-MCPD衍生物的保留时间比较接近，所以3-MCPD衍生物选择2-MCPD衍生物所不含有的m/z453（169）作为定量离子。同样D5-3-MCPD衍生物选择特异性比较好的m/z456（169）作为定量离子。

2.2 分析方法验证

2.2.1 线性范围

取10 个不同质量浓度（0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、1.00、2.00、4.00、6.00 mg/L）3-MCPD标准溶液，衍生化后分别进样。因为质量浓度范围过宽，低质量浓度的标准品计算值不稳定。所以，在实际测样品时分别以不同质量浓度0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg/L和不同质量浓度0.200、0.500、1.00、2.00、4.00、6.00 mg/L各标准系列溶液3-MCPD七氟丁酰衍生物峰响应值与内标物响应值的比值（Y）与3-MCPD与其内标物质量浓度的比值（X）作线性回归分析。

3-MCPD在0.001 0～0.020 ng和0.020～0.06 ng范围时，线性回归方程分别为Y=-0.034 648＋0.070 278 3X，R2=0.997 2和Y=0.176 325＋0.066 762 7X，R2=0.999 5；线性均良好。

2.2.2 回收率与精密度

选取含3 种以上调味料的菜肴（鱼香肉丝）作为代表性样品，准确称取2.000 g，分别添加2.000、5.000、10.00 mg/L PP-3-MCPD标准溶液0.100 mL，经提取净化后衍生化处理。每个添加平行测定3 次，结果如表2所示。

表 2 方法回收率与精密度Table 2 Recoveries and precision of the method

从表2可知，本方法3-MCPD的加标回收率在95.0%～115.0%之间，相对标准偏差为2.9%～6%。

2.3 菜肴中3-MCPD和3-MCPD酯含量结果

由表3可知，食堂菜肴中3-MCPD酯含量在43.56～178.8 μg/kg之间，3-MCPD含量在3.48～30.51 μg/kg之间。3-MCPD酯含量远高于3-MCPD，二者的比值在3.34～20.61之间。由表4可知，餐馆菜肴中3-MCPD酯含量在9.87～2 162.19 μg/kg之间，3-MCPD含量在3.69～40.24 μg/kg之间，3-MCPD酯与3-MCPD含量比值在2.67～73.52之间。在所有菜肴中均检出3-MCPD酯和3-MCPD，可以看出它们在菜肴中的存在具有普遍性。而3-MCPD酯与3-MCPD含量比值远大于1，说明3-MCPD酯较3-MCPD为更常见的一种存在形式。

表 3 食堂菜肴中3-MCPD及3-MCPD酯分析结果Table 3 Contents of 3-MCPD and its esters in school canteen dishes

表 4 餐馆菜肴中3-MCPD及3-MCPD酯分析结果Table 4 Contents of 3-MCPD and its esters in restaurant dishes

食堂菜肴中的3-MCPD酯和3-MCPD含量普遍低于餐馆菜肴。值得注意的是餐馆菜肴中炖菜中3-MCPD酯和3-MCPD的含量较低。这可能是因为炖菜中水分含量高，3-MCPD酯的含量变化与含水量直接相关，在100 ℃条件下，随水含量的增多而增多，20%含水量时达到最大值，而后下降显著[29]。在炖菜中，大白菜炖豆腐中3-MCPD酯和3-MCPD的含量最低，而杏鲍菇炖山鸡和西红柿炖牛腩中3-MCPD无明显增加，但3-MCPD酯的含量明显增多，尤其是西红柿炖牛腩中3-MCPD酯含量达到123.12 μg/kg，这可能是不同食材对3-MCPD酯含量的影响不同。Yu等[30]对不同鸡胸肉油炸后对煎炸油进行研究，结果表明在160 ℃时，3-MCPD酯含量随油炸时间延长而增加，然而对油炸土豆中的煎炸油进行分析却得到了相反的结果，3-MCPD酯随油炸时间延长呈现下降趋势[31]，说明3-MCPD酯的分解量多于形成量。因此不同基质对3-MCPD酯形成的影响可能不同。烧制烹调先以食用油为导热媒介，后以水为传热介质实现加工目的，所以烧制的菜肴的温度较油炸、干锅等低，造成3-MCPD酯含量较低。周红茹[32]对不同温度条件下3-MCPD酯含量进行分析，结果表明加热到1 h时200 ℃条件下的生成量大于100 ℃，说明3-MCPD酯在高温下生成速率小于分解速率。

在餐馆菜肴中，油炸制法的菜肴中3-MCPD酯含量最高，而3-MCPD含量也较高，这可能是因为油炸中油脂含量高有关。很多研究者都认为在高含量3-MCPD酯存在与食品中的高油脂含量相关，如Markus等[33]用GC-MS检测食品中氯丙醇酯含量，其中含量最高为人造黄油样品；Becalski等[22]对加拿大市场中的食品进行了氯丙醇酯含量的检测，同样发现核桃、米糠、葡萄籽油和棕榈油中的含量较高。

干锅菜肴中3-MCPD酯与3-MCPD含量也普遍较高，这可能与加热时间长有关，而炒菜虽然加工温度比较高，但烹调时间短，所以3-MCPD和3-MCPD酯生成的量相对比较少。因此烹饪加热时间对3-MCPD酯的形成也有重要的影响。这与相关文献报道一致。Li Chang等[14]对油脂在精炼过程中的形成进行分析，3-MCPD酯在脱臭温度（220～260 ℃）随加热时间延长而增高，1.0～1.5 h达到峰值后降低。

如图3所示，3-MCPD酯和3-MCPD在不同烹饪方式中的变化规律：5 种烹饪工艺制成的菜肴中3-MCPD与3-MCPD酯差异规律相同；不同传热介质烹调而成的菜肴中3-MCPD酯和3-MCPD含量由高到低依次为炸＞干锅＞炒＞烧＞炖。

图 3 不同烹饪方式餐馆菜肴中3-MCPD及3-MCPD酯的平均含量Fig. 3 Average contents of 3-MCPD and its esters in dishes produced by different cooking processes

根据《中国居民膳食指南2016》[34]要求，蔬菜推荐每日食用量为300～500 g，动物类每日食用量为120～200 g，中国居民的每日平均食用量为560 g。3-MCPD酯及3-MCPD含量按所有菜肴的平均值计算，食堂菜肴中的平均含量分别为75.86 μg/kg和10.43 μg/kg，餐馆中的平均含量分别为516.11 μg/kg和17.88 μg/kg。若成人按65 kg体质量计算，并假设3-MCPD酯可100%的转化为3-MCPD，那么食堂菜肴中3-MCPD酯及3-MCPD的摄入量约为每天0.65 μg/kg和0.09 μg/kg。餐馆菜肴中3-MCPD酯及3-MCPD的每天摄入量约为4.45 μg/kg和0.15 μg/kg。食品添加剂联合专家委员会（Joint Expert Committee on Food Additive，JECFA）提出3-MCPD的PMTDI为2 μg/（kg·d）。根据标准餐馆菜肴中3-MCPD酯超出JECFA推荐的PMTDI值，为该标准的2.2 倍。一些研究者也对不同种类食品中3-MCPD酯的暴露量进行评估，里南[25]对油炸食品进行了暴露量分析，以污染水平的97.5%分位数计，3-MCPD酯的暴露量分别为3.04 μg/kg和6.08 μg/kg，为安全计量的1.52 倍和3.04 倍。Spungen等[35]对婴儿配方奶粉中3-MCPD酯的暴露量进行评估，结果为7～10 μg/kg。Weißhaar[20]对超过200 种精炼油脂的数据进行分析，结果表明3-MCPD酯的暴露量为1.5 μg/kg（占75%），说明很可能有部分人群已经超标。以上结果表明，部分食品按3-MCPD的标准评估3-MCPD酯已超PMTDI值。

3 结 论

在所有检测菜肴中均检出3-MCPD酯和3-MCPD，可以看出其在菜肴中的存在具有普遍性。食堂菜肴中3-MCPD酯含量在43.56～178.8 μg/kg之间，3-MCPD含量在3.48～30.51 μg/kg之间。3-MCPD酯含量远高于3-MCPD，二者的比值在3.34～20.61之间。餐馆中3-MCPD酯含量在9.87～2 162.19 μg/kg之间，3-MCPD含量在3.69～40.24 μg/kg之间，3-MCPD酯与3-MCPD含量比值在2.67～73.52之间。不同的烹饪方式产生3-MCPD酯和3-MCPD的量不同，含量由高到低依次为炸＞干锅＞炒＞烧＞炖。根据3-MCPD酯和3-MCPD暴露量计算结果，食堂菜肴中3-MCPD酯和3-MCPD的摄入量低于JECFA推荐的PMTDI值，而餐馆菜肴中3-MCPD酯的摄入量高于JECFA推荐PMTDI值的2.2 倍，3-MCPD并未超标。目前在短时间加热过程中3-MCPD酯与3-MCPD含量变化规律的研究不足，所以对于炒菜中各影响因素的研究仍有待进行。