冻干驴乳粉全成分分析

贴航，廖峰，薛圣然，张建岭，苏宁

(1.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；2.中检科（北京）化妆品技术有限公司，北京 100176；3.国家胶类中药工程技术研究中心，东阿阿胶股份有限公司，山东东阿，252201)

0 引 言

目前，驴乳以其营养价值和健康效益逐渐引起了人们的关注。与其他原料乳相比，驴乳最重要的特征是其营养成分与母乳类似，且有许多独特的优势[1]。因此，在牛乳蛋白过敏的情况下，与其他反刍动物乳相比，驴乳是良好的婴儿营养的替代品[1]。唐代孙思邈《千金要方》和明代李时珍《本草纲目》记载了驴乳的药用价值，驴乳可治疗糖尿病和“疮”[2]。Hip⁃pocrates 和Pliny 也记载说明，驴乳可治疗肝脏、传染病、发烧和哮喘等疾病[3]。在古代，欧洲贵族也有利用驴乳洗澡和敷面以保持容颜和皮肤弹性的记载[4]。现在药理研究也表明，驴乳具有降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎等活性[5]。但是驴乳发挥功效的分子基础却不是很明确。

目前对驴乳的研究主要集中在低致敏性临床研究、泌乳期特征、化学成分分析、功能性研究等方面，但是缺乏对我国特有品种——德州驴驴乳全成分的系统研究。本文采用超高效液相串联两种不同质量分析器的高分辨质谱技术对驴乳粉中的主要营养成分进行定性定量的分析。不仅提高了对驴乳的认识，也为驴乳的深层次开发提供理论依据。

1 实 验

1.1 材料与试剂

驴乳粉由东阿阿胶股份有限公司提供。

ACQUITY UPLC HSS T3 柱（Waters）；乙腈、甲醇、甲酸均为质谱纯，购自J&K；2-氯苯丙氨酸（GL Biochem(Shanghai)Ltd.）。

1.2 仪器

LC-MS（Thermo，Ultimate 3000LC，Orbitrap Elite）。

2 方 法

2.1 样品预处理

称取约50 mg 样品，加入到800 μL 甲醇溶液中，并加入10 μL内标（3.0 mg/mL，2-氯苯丙氨酸）。将其置于组织研磨仪中65 Hz研磨120 s。水浴超声30 min而后置于4 ℃离心机中，12 000 rpm 离心15 min，吸取200 μL上清，转入进样小瓶中，待LC-MS检测分析。

2.2 色谱条件

方法参考文献[6]，略有改动。Waters ACQUITY UPLC HSS T3 柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温为40 ℃，流速恒定0.3 mL/min。流动相组成：A 相，水+0.1%甲酸；B 相，乙腈+0.1%甲酸。进样量4 μL，自动进样器温度4 ℃。流动相梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相洗脱程序

2.3 质谱条件

正模式：加热器温度300°C；鞘气流速：45 arb；辅助气流速：15 arb；尾气流速：1 arb；电喷雾电压：3.0KV；毛细管温度：350°C；S-Lens RF Level,30%。

负模式：加热器温度300°C；鞘气流速：45 arb；辅助气流速：15 arb；尾气流速：1 arb；电喷雾电压：3.2 KV；毛细管温度：350°C；S-Lens RF Level,60%。

扫描模式：一级全扫描(Full Scan，m/z 50～1000)与数据依赖性二级质谱扫描(dd-MS2，TopN=10)；分辨率：60,000(一级质谱)&17,500(二级质谱)。碰撞模式：高能量碰撞解离（HCD）。

3 结果与分析

应用多质量分析器组合式质谱仪对驴乳粉进行MSn级扫描，最终获得驴乳粉主要代谢产物信息，形成样本的营养成分谱库。图1 为驴乳粉的总离子流图。根据Compound Discoverer 软件处理得到Mass 数据，基于Metlin 进行全谱鉴定。共鉴定出87 种代谢物，详细信息见表2。代谢物可以分为氨基酸及其衍生物、糖、有机酸、脂质等。

图1 驴乳粉的总离子图

3.1 氨基酸及其衍生物

从表2 可知，从驴乳粉中鉴定出16 种氨基酸及其衍生物，其中有6 种必需氨基酸。郭慧媛[7]和李宇[8]等报道，驴乳含有除色氨酸外的8 种必需氨基酸。但是，本试验却发现驴乳含有色氨酸，这与张岩春[9]等人的报道一致。值得注意的是，驴乳富含γ-氨基丁酸、牛磺酸、焦谷氨酸、酪氨酸等活性氨基酸。γ-氨基丁酸是哺乳动物体内一种神经抑质，可减缓机体氧化应激。γ-氨基丁酸可通过激活GSK-3β/Nrf-2 通路保护胰腺组织、减少胰岛β细胞损伤和影响mTOR/S6K1/IRS-1 途径提高肌肉对胰岛素的敏感性，进而缓解2 型糖尿病患者的胰腺损伤和胰岛素抵抗状态[10]。牛磺酸是条件性必需氨基酸，补充适量牛磺酸能够降低糖尿病动物血糖水平，改善糖尿病症状，且牛磺酸无任何毒副作用[11]。焦谷氨酸不仅具有胰岛素样作用，促进葡萄糖合成脂肪[12]；而且是皮肤的天然保湿因子，也对酪氨酸氧化酶等酶类的活性有一定抑制作用，阻止“类黑素”物质在皮肤中积沉，使皮肤亮白[12-13]。这些物质从分子角度揭示了驴乳防治糖尿病和具有美容养颜功效的分子机制，也为驴乳防治糖尿病机制提供新的思路。

表2 驴乳粉LC-MS全谱鉴定

（续表2）

（续表2）

3.2 糖类

因驴乳是目前发现的最接近母乳的天然替代物，因此国内外学者对驴乳中的乳糖及低聚木糖含量研究较多，但是对驴乳中其他糖类的表征研究较少[14]。Murgia 等[14]利用GC-MS 技术发现驴乳中含有果糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖、帕拉金糖等糖类。本文利用ESI-多重质谱技术鉴定出驴乳含有6 种糖类，分别是木糖酸、己糖、糖醇、葡萄糖酸、海藻糖和N-乙酰-α-氨基葡萄糖-1-磷酸酯，首次在驴乳中鉴别出海藻糖。但是，海藻糖广泛存在于细菌、真菌、酵母、植物和低等动物中，哺乳动物不具备海藻糖合成能力[15]，因此需进一步验证驴乳中是否存在海藻糖。

3.3 有机酸类

乳制品存在有机酸是正常产奶动物的生化代谢过程，比如柠檬酸、马尿酸、尿酸、乳清酸等。但是目前国内外学者对驴乳有机酸的研究较少。Murgia等[14]利用GC/MS 发现驴乳中含有乳酸、苹果酸、琥珀酸、柠檬酸等11 种有机酸。本文利用LC/MS 技术检测到驴乳含有乳酸、苹果酸、柠檬酸、水杨酸、尿酸、马尿酸等11 种有机酸。其中，尿酸、马尿酸是首次在驴乳中发现的有机酸。尿酸作为乳中的抗氧化剂，可能对新生仔驴肠道黏膜具有局部保护作用[16]。柠檬酸能显著抑制仔猪肠道乳杆菌属和双歧杆菌属的增殖，但是低剂量的乳酸能显著促进乳杆菌属和双歧杆菌属的增殖，柠檬酸、苹果酸、乳酸等均能有效抑制病原菌的增殖[17]。因此，乳中有机酸对调节饮用乳制品人群的肠道菌群平衡有着重要的意义。

3.4 脂质类

Martini[18]、Antonella[19]和豆智华[20]等学者对驴乳脂肪酸谱进行了广泛的研究。相比于牛乳，驴乳中的脂类更接近母乳中脂类成分：必需脂肪酸的含量高，低饱和脂肪酸的含量低。通过LC/MS 检测到驴乳粉共有46 种脂类物质，其中大多数的脂类是不饱和脂肪酸，且不饱和脂肪酸含量很高。驴乳粉中癸酸和月桂酸的含量较高，而棕榈酸和硬脂酸的含量较低，这与Barlowska 等[21]的报道一致。利用LC/MS 首次在驴乳粉中检出杜鹃花酸，杜鹃花酸对表皮葡萄球菌、头状葡萄球菌、皮屑芽孢菌等细菌有很好的抗菌效果[23]。杜鹃花酸也对治疗色素沉着和痤疮有很好的效果[22]，这从分子角度解释了驴乳在美容和治疗“疮”方面的功效。

3.5 其他

利用多重质谱在驴乳粉中还鉴定出黄嘌呤、丙二醛、磷酸、尿囊素、香叶酸、肌肽、雄甾烯醇7 种成分。尿囊素是尿酸的衍生物，用途十分广泛。在医药方面，尿囊素具有促进细胞生长、加快伤口愈合、软化角质蛋白等生理功能，是皮肤创伤的良好愈合剂和抗溃疡药剂，对糖尿病、痤疮均有较好的疗效；在化妆品方面，尿囊素具有杀菌、抗氧化作用，能使皮肤保持水分，广泛用于雀斑霜、粉刺液等产品[23]。肌肽可通过抗氧化、抑制端粒缩短和线粒体损伤、抗糖基化等作用抑制衰老[24]。肌肽也作为主要的抗氧化成分广泛应用于化妆品中。也有研究表明[25]，肌肽可能通过降低左心室氧化应激和炎症反应改善1 型糖尿病大鼠心功能障碍。这些成分的存在，从分子水平解释了驴乳“防消渴”等功效。

4 结 论

利用HPLC 串联多重质谱的手段鉴定出驴乳粉中的87 种代谢物，主要有氨基酸及其衍生物类、糖类、有机酸类、脂质类和其他5 大类。驴乳粉不仅含有6种必需氨基酸，而且含有γ-氨基丁酸、牛磺酸、焦谷氨酸等活性氨基酸，从分子基础上揭示了驴乳防治糖尿病和美容养颜的潜在功效。首次在驴乳粉中鉴定出海藻糖、尿酸和马尿酸等成分。但还需进一步确认驴乳粉中海藻糖的存在。驴乳富含多不饱和脂肪酸，这为驴乳发挥降血脂等功效提供了物质基础。杜鹃花酸的存在为驴乳美白、治疗痤疮等功效的分子机制研究提供了思路。驴乳也富含尿囊素和肌肽等生物活性成分，进一步从分子水平解释了驴乳在美容养颜和防治糖尿病的机制。本研究对驴乳粉进行了较为系统的化学成分和生物活性成分研究，为阐明驴乳粉的化学组成及扩大其效用范围提供了科学数据与理论依据。