应用PacBio SMRT测序技术分析蒙古传统奶酪细菌多样性

任冬艳，莫蓝馨，靳昊，潘琳，马腾，于洁，孟和毕力格

（内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室，农业农村部奶制品加工重点实验室内蒙古自治区乳品生物技术与工程重点实验室，呼和浩特010018）

0 引 言

传统工艺制作的蒙古奶酪制品是蒙古民族人们日常饮食中不可缺少的部分。蒙古传统奶酪的制作工艺不同于欧洲的酶凝乳奶酪，将鲜乳置于室温下自然发酵酸化凝固，然后加热凝乳排出乳清后放进模具或木盘中挤压成型，自然干燥后即可食用[1]。在奶酪制作过程中，乳酸菌等多种微生物参与其中，对奶酪的口感、风味、质地、颜色、营养特性和食用安全性都有很大的影响[2]。因此，了解蒙古传统奶酪的细菌多样性对于传统奶酪的品质改良及其食用安全评估具有重要意义。

本研究通过PacBio SMRT 测序技术分析蒙古奶酪样品中的细菌多样性。并从公共数据库中下载了19 份来自布里亚特和意大利传统奶酪的16S rRNA 基因序列，与蒙古奶酪进行了比较分析，旨在揭示不同地区奶酪样品的细菌群落结构差异性。

1 实 验

1.1 材料与仪器

（1）样品采集。本研究所用的9 份传统奶酪样品(R1-R9)采集自蒙古地区的9 个牧民家庭，样品采集后立即加入保护剂，迅速冷冻、密封，并尽快运回实验室进行后续试验。

（2）试剂。OMEGA eZNA Soil DNA Kit 试剂盒，美国OMEGA 公司；蛋白酶K，北京全式金生物技术有限公司；KAPA HiFiHot Start Ready Mix PCR Kit，美国KAPA 公司；PCR 试剂，大连TaKaRa 公司；5×TBE 电泳缓冲液（Tris 碱54 g、Na2EDTA·2H2O 3.72 g、硼酸27.5 g，定容至1 000 mL，pH 8.0）、1.0%的琼脂糖胶（1.0 g 琼脂糖溶于100 mL 0.5×TBE 缓冲液），天津基准化学试剂公司。

（3）仪器。Eppendorf 5810R 台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；CDS8000型UPV 凝胶成像分析系统，北京赛智创业科技有限公司；DYY-12 电泳仪，北京六一仪器厂；ND-1000 型微量紫外分光光度计，美国Nano Drop 公司；AB/Life 梯度PCR 仪，美国AB 公司；Pacifico SMRT RS II 测序平台，美国PB 公司。

1.2 方法

1.2.1 样品DNA 提取

取2 g 碾碎的奶酪样品，用OMEGA eZNA Soil DNA Kit 试剂盒提取样品中的基因组DNA。对样品DNA 的完整度、纯度以及浓度进行检验，经检验合格的DNA 用于后续实验。

1.2.2 样品16SrRNA 基因片段扩增

DNA 扩 增 采 用 细 菌 16S 通 用 引 物27F(5-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-ACCTTGTTACGACTT-3')。为了区别不同样品将每对引物分别加有16个碱基长度的barcode。

PCR 反应扩增体系为50 μL：正、反向引物（浓度10 μmol/L）各2 μL，模板DNA（＜100 ng）1 μL，1×PCRBIO buffer 10 μL，Taq DNA polymerase 1 μL，ddH2O 34 μL；

扩增条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环，72 ℃末端延伸7 min。

1.2.3 PacBio SMRT 三代测序

PCR 反应产物经Agilent DNA 1000 Kit 和Agi⁃lent 2100 Bioanalyser 检验合格后，使用Pacific Biosci⁃ences Template Prep Kit 2.0 试剂盒构建文库，用PacBio RS II仪器P6-C4试剂上机测序。

1.2.4 序列质控

使用RS_ReadsOfinsert.1 对原始下机数据进行测序质量控制，要求：(1)插入片段重复测序的次数≥5；(2)最小预测精确度为90；(3)最小插入序列长度为1 400 nt 为生物学中描述DNA 常用的单位，指核苷酸数，通常用于描述单链，如RDA，primer等。(4)最大序列长度为1 800 nt[3]。

1.2.5 生物信息学分析

质控合格的序列根据barcode 序列拆分不同的样本，并去除barcode 和引物序列以进行后续的分析。筛选意大利和布里亚特样品的16S rRNA 基因序列超过450 bp 的基因片段。应用QIIME 平台（v1.70），对高质量的序列进行生物信息学分析，主要包括：（1）PyNAST 校准并排齐序列，在100%相似性下进行UCLUST 归并后，在97%相似性下聚类获得分类操作单元（Operational taxonomic units,OTU）[4]；（2）通过chimeraslayer 去除嵌合体序列后，基于RDP(ribosomal database project, release11.5) 和 Greengenes(Release 13.8）数据库对OTU 代表性序列进行同源性比对，确定每个OTU 分类学地位[5]；（3）使用FastTree 软件绘制系统发育进化树[6]；（4）以所有样品中测序量最低的样品测序量为基准，计算各样本香农指数（Shan⁃non-Wiener index）、辛普森指数（Simpson index）、超1指数（Chao1 index）和发现的物种数量指数（Observed species）用于评估各样本α 多样性。（5）使用UniFrac距离进行加权(weighted)和非加权(unweighted)的主坐标分析，揭示各个样本之间菌群结构的差异。

1.2.6 数据处理

分别采用Wilcoxon 秩和检验和Kruskal-Wallis 多组检验比较样品间差异。使用Origin 8.6 软件和R 语言软件对QIIME产生的结果进行分析和可视化处理。

2 结果与分析

2.1 蒙古奶酪中细菌丰度及多样性

本研究通过超1 指数、发现物种数、香农指数和辛普森指数评估蒙古奶酪样品细菌丰度和多样性。样品的测序序列信息和α 多样性指数如表1 所示，样品R1 细菌丰度及多样性最高，R4 和R5 细菌丰度及多样性最低。通过对测序所得序列进行筛选后，9 个蒙古奶酪样品共获得64,926 条高质量的序列，平均每个样品产生7,214 条。按序列97%的相似度进行操作分类单元划分及嵌合体检查去除，将剩余的4,243 个OTUs 纳入下一步分析，平均每个样品剩余471 个OTUs。

为了直观反映当前测序量和97%相似度水平上各样品的生物多样性，本试验用稀疏曲线和香农多样性曲线对各样品文库进行分析。从图1 结果发现，在测序量较少时，发现OTU 的数量和香农多样性指数随着测序量的增加而增加，但随着测序量继续增大时，图1（a）稀疏曲线中新增OTU 的数量逐渐变缓且最终没有达到平衡状态，说明随着测序量增加有可能会有新的细菌种系型被发现。而从图1（b）香农曲线中看，随着测序量增加香农曲线已进入平台期，说明在该测序深度下，可以充分展示样品的细菌多样性。因此本研究中细菌测序量满足后续生物信息学分析的要求。

2.2 蒙古奶酪中细菌群落结构

在门水平上，9 份蒙古奶酪中共检测到4 个细菌菌门，主要菌门是变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes），平均相对含量分别是85.59%和14.13%。

表1 蒙古奶酪样品的测序序列信息和α 多样性指数

图1 蒙古奶酪样品稀疏曲线和香农曲线

在属水平上，共鉴定到60 个细菌菌属，主要菌属有肠杆菌属（Enterobacter）、链球菌属（Strepto⁃coccus）、乳球菌属（Lactococcus）、厌氧芽孢杆菌属（Anoxybacillus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和芽孢杆菌属（Bacillus），这些属的平均相对含量分别为82.34%，5.74%，3.19%，2.27%，1.35%和1.17%，如图2 所示。在属水平上，9 份奶酪样品的细菌群落结构表现出了一定的差异性。

在种水平上，共鉴定到76 个细菌菌种，主要菌种有霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、乳酸乳球菌（Lacto⁃coccus lactis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）和德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii），上述菌种的平均相对含量分别为81.46%，5.65%，2.98%，1.05%，0.81%和0.51%，如图3 所示。其中霍氏肠杆菌为所有样品的优势菌种，尤其在R4 和R5 样品中相对含量最高，而嗜热链球菌在R2，R3 和R8 样品中相对含量最高，乳酸乳球菌在R6 和R7 样品中相对含量最高，瑞士乳杆菌主要是在R1 样品中，德氏乳杆菌主要在R8和R9样品中相对含量最高。

2.3 蒙古奶酪与意大利和布里亚特奶酪细菌多样性的比较

为了探究不同地区传统奶酪中细菌菌群结构的差异，本研究从数据库中下载了布里亚特和意大利奶酪的序列与蒙古奶酪进行了比较分析。首先，对三个地区奶酪样品的丰度和多样性进行了比较，发现意大利地区奶酪样品的丰度和多样性最高，而蒙古地区奶酪样品的丰度和多样性最低（如图4）。

图2 在属水平奶酪样品的细菌组成

图3 在种水平奶酪样品的细菌组成

图4 不同地区样品测序量及α多样性比较

然后，利用加权和非加权的UniFrac 距离进行了PcoA 主坐标分析来研究三个地区奶酪样品的细菌菌群结构差异，在加权和非加权评分图上（图5），代表三个地区的点都明显的区分开，说明三个地区的奶酪样品间存在着显著的差异（P＜0.005）。

图5 基于加权和非加权的UniFrac距离主坐标分析

为了进一步确定三个地区奶酪样品的菌群结构差异体现在哪些菌株上，本研究采用Wilcoxon 秩和检验和Kruskal-Wallis 检验对三个地区奶酪样品中菌种进行了比较分析，差异显著且相对含量大于0.5%的菌种如图所6 示。发现与其它两个地区奶酪样品相比较蒙古奶酪样品差异显著的菌种为霍氏肠杆菌和巴氏醋杆菌（P＜0.05），布里亚特奶酪样品与其它两个地区奶酪样品相比较差异显著的菌种为乳酸乳球菌、棉子糖乳球菌和副猪链球菌（P＜0.01），而意大利奶酪样品与其他两个地区奶酪样品相比较差异显著的菌种为嗜热链球菌、德氏乳杆菌、瑞士乳杆菌和鸡乳杆菌（P＜0.005）。

3 讨 论

图6 不同地区奶酪样品中差异显著的细菌比较分析

本研究采用SMRT 测序技术来描述蒙古奶酪的细菌多样性，共鉴定到隶属于4 个细菌菌门、60 个细菌菌属的76 个细菌菌种。其中霍氏肠杆菌为蒙古传统奶酪样品的绝对优势菌种，在每个样品中都以较高的含量存在。除了霍氏肠杆菌之外，本研究还检测到较高含量的嗜热链球菌、乳酸乳球菌和瑞士乳杆菌等乳酸菌的存在。其中，嗜热链球菌在样品R2，R3，R4，R5 和R8 中相对含量较高，乳酸乳球菌在样品R6和R7 中相对含量较高，瑞士乳杆菌在样品R1 中相对含量较高。由此可见，本研究9 份蒙古奶酪的细菌群落结构既有共性也有一定的差异。可能是由于牧民制作奶酪的方法、时间以及环境的不同而导致的。可以影响奶酪的感官品质[10]。Tornadijo 等人发现在奶酪成熟初期肠杆菌活菌数可达106～107cfu/g，之后随着奶酪的成熟逐渐减少[11]。霍氏肠杆菌的存在反映了蒙古传统奶酪制作过程中不良的卫生条件。蒙古传统奶酪主要是当地牧民以传统的手工方法进行制作，没有添加任何的发酵剂，这就意味着其质量和特性主要取决于内源微生物群，同时，奶酪加工过程发酵所处的开放自然环境以及所用到的器具都会对奶酪中微生物群落结构造成影响。在牛奶预处理、制作及储存过程中，环境、挤奶人员和器具等卫生条件不足可能导致最终奶酪制品受到污染[12-13]。然而，利用纯培养技术对本试验所用样品中的细菌进行分离鉴定，却并未分离出霍氏肠杆菌，说明该菌在奶酪发酵初期确实存在过，而随着加热等工艺的应用，该菌已经不是活着的状态。本研究中蒙古传统奶酪的乳酸菌主要有嗜热链球菌、乳酸乳球菌和瑞士乳杆菌。乳酸菌在奶酪生产过程主要通过发酵乳糖和水解蛋白来提高奶酪的感官特性。嗜热链球菌是乳品工业中最重要的乳酸菌，它可以改善乳酸发酵的生态环境，并且通过抑制胆固醇合成酶的活性而降低胆固醇水平[14]。乳酸乳球菌是工业化生产酸奶及奶酪中常用到的发酵剂，具有快速酸化和凝乳能力，还可以通过促进乳酸形成来增强奶酪风味和质地[15]，对奶酪的感官特性做出了显著贡献。瑞士乳杆菌也是一种常用的奶酪发酵剂，瑞士乳杆菌具有较高的蛋白水解活性，这一特性在减少奶酪苦味方面发挥了重要作用[16]。此外，一些瑞士乳杆菌的蛋白水解活性被认为在产生抗高血压肽中具有重要作用[17]。

为了进一步了解蒙古奶酪的细菌群落结构特征，从公共数据库中下载了布里亚特和意大利的传统奶酪的16S rRNA 基因序列，并与本研究采集的蒙古奶酪进行了比较分析，PCoA 和MANOVA 分析表明不同地理位置的奶酪菌群结构存在差异。Zhong 等人对中国不同省份的自然发酵乳中细菌菌群进行了分析，跟本研究结果相似，发现乳制品中的细菌群落结构随着地理位置的不同而表现出了差异性[18]。Xue 等人研究了中国不同地区的乳扇细菌群落结构，发现不同产地的乳扇有不同的细菌群落特征。对传统发酵蔬菜食品[19]和自制发酵牛奶[20-22]进行细菌多样性研究也可以得到相似的结论。地理因素主要是指海拔、气候、温度、大气压、阳光等各种环境因素的差异[23]。这些因素共同塑造了传统乳制品的细菌群落。除了地理位置之外，奶酪的制作工艺和环境条件等因素也影响发酵后产品的微生物群落结构[24]。这些因素共同促使奶酪产品形成其独特的细菌菌群结构。

4 结 论

本研究采用SMRT 测序技术对9 份蒙古奶酪样品进行了细菌群落分析。共鉴定出4 个门，60 个属，76 个种，其中霍氏肠杆菌（81.46%）、嗜热链球菌（5.65%）和乳酸乳球菌（2.98%）为优势菌种。通过将本研究产生的16S rRNA 基因序列与从公共数据库中下载的序列进行比较分析，发现不同地区的奶酪在细菌群落组成确实存在差异。本研究中蒙古传统奶酪除了检测到嗜热链球菌、乳酸乳球菌外，还检测到大量霍氏肠杆菌存在的痕迹，反映了蒙古传统奶酪在制作过程中不良的卫生条件，在传统奶酪制作过程中应采取适当的措施预防污染，从而保证奶酪最终质量和产品感官特性。