嗜热链球菌grx90冻干保护剂的制备

陈萱，赵瑞峰，陶志强，王丽，黄欣媛，陆震，印伯星，顾瑞霞，关成冉

(1.江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室扬州大学，江苏扬州225127；2.华熙生物科技有限公司，济南250101；3.江苏省乳业生物工程技术研究中心，江苏扬州225100)

0 引 言

乳酸菌（Lactic acid bacteria）是一类公认安全并可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称[1]，在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。其中，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）是唯一广泛应用于食品发酵的链球菌，其作为发酵剂在乳制品生产过程中起着重要的作用。随着人民生活水平的提高，我国发酵乳制品工业的迅猛发展，发酵乳的产量日益增加，日益成为食品科学的研究热点[2]。

随着低温干燥技术的发展，目前己开发出用量小、运输储藏方便、直接投入生产的多功能商品化发酵剂，即冷冻干燥发酵剂[3]。但是在实际干燥过程中依然会出现细胞不可逆损伤，导致复水后菌体大量死亡。研究表明，在冷冻干燥过程中添加一定比例的保护剂能提高菌体冻干存活率[4]。保护剂一方面可以改变生物样品冷冻干燥时的环境，减轻或防止冷冻干燥对菌体细胞物理、化学损伤或复水对细胞的损害[5]，尽可能保持菌体原有的代谢活性，另一方面可以作为支撑物在复水过程中为菌体提供一定的骨架结构[6]。

本实验以本实验室分离出的专利菌株嗜热链球菌grx90 为研究对象，以其在冷冻干燥复水后的细胞存活率为评价指标，对冻干过程中的离心条件、冻干保护剂配方及条件进行优化，以期提高菌体在冷冻保藏过程中的存活率，为食品工业发酵剂的冻干保藏提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

JF-SX-500 高压蒸汽灭菌锅，日本TOMY 公司；DNP-9272 恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；PL2002 电子天平，梅特勒公司；5804R 高速冷冻离心机，德国EPPEENDORF 公司；FREEZONE 18L冷冻干燥机，美国LABCONCO 公司。

1.2 菌种

本试验所用嗜热链球菌grx90 扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室分离、筛选和保存的专利菌株。

1.3 培养基

MRS 培养基：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、无水乙酸钠5.0 g、柠檬酸铵2.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、七水硫酸镁0.6 g、四水硫酸锰0.3 g、吐温80 1.0 mL、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、水1.0 L、琼脂15.0 g。

1.4 菌体的收集

将活化2 代的嗜热链球菌grx90 培养液离心，按照8 000 r/min、10 000 r/min、12 000 r/min 的转速分别离心8 min、10 min、12 min，离心后倾去清液，并称重记录，计算出菌泥获得率。此后用生理盐水补充至离心前的体积，进行活菌计数。通过比较离心后的细胞存活率和菌泥重量，选取在细胞存活率最大且菌体收集效果较好的离心条件下来收集菌体，供下一步试验用。细胞存活率和菌泥获得率公式如下：

菌泥获得率/%=(M1-M2)/(M3-M4)×100%

式中：M1－离心后离心管总重（g）;

M2－离心管空重（g）;

M3－终止培养时培养物和试管总重（g）;

M4－干试管空重（g）;

细胞存活率（%）=S1/S2×100%

式中：S1－离心后存留活菌数（cfu/mL）;

S2－离心前活菌总数（cfu/mL）。

1.5 保护剂配方优化

1.5.1 保护剂添加物的确定

保护剂中的不同成分对于菌体有不同的保护作用，参照昝继清等人的方法[7]并加以改动，以12%脱脂乳为保护剂基质，按照表1 通过单因素实验添加2%醇类、0.2%盐类、0.2%氨基酸类[4]以及10%糖类，将保护剂分别与菌泥按体积1∶1 均匀混合，装液高度为7 mm，-80 ℃预冻12 h 后进行冻干，计算细胞存活率来确定最适添加物。

表1 保护剂添加物

1.5.2 正交优化

筛选出最佳各添加物后，通过正交实验以复水后的细胞存活率为指标优化冻干保护剂配方的含量，实验因素水平如表2。

表2 正交优化实验设计因素水平 %

1.6 保护剂及冻干条件的优化

1.6.1 保护剂与菌体混合比例的优化

利用前面所确定的最优保护剂配方，将菌种与保护剂分别按照1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 混合，计算存活率。

1.6.2 装液高度的优化

装液高度为5、6、7、8、9、10 mm 的五组样品测定冻干前后活菌数，计算存活率筛选出最适装液高度。

1.6.3 预冻时间的优化

将样品分别预冻4、8、12、16、20 h，测定冻干前后活菌数，计算存活率，筛选出最适预冻时间。

本文以零件配套生产问题为例，研究了针对生产资源的不同属性多角度地选择决策变量来建立优化生产模型的方法，为企业管理者提供更多的生产决策依据，通过实例数据及其求解也验证了三种模型及其优化生产方案的有效性，同时也指出了各自的优缺点．企业管理者可以根据本企业的实际情况合理的选取生产方案．

1.7 冻干存活率的测定

1.7.1 菌落计数

采用平板计数法。

1.7.2 冻干存活率的计算。

存活率（%）=冻干复水后1 mL 样液的活菌数/冻干前1 mL样液的活菌数×100%

1.8 数据处理

每个指标重复3 次，取平均值并采用Origin 分析软件对实验数据进行处理。

2 结果与讨论

2.1 离心条件的优化

菌体收集是发酵剂工业化生产的关键步骤，虽然有膜滤浓缩等更先进的手段，但是考虑到成本以及效率的问题，离心依然是现代工业菌体收集的主要方式。但是菌株在高转速以及长离心时间的环境中易受到剪切力的影响，发生细胞破碎导致细胞存活率降低[8]。本部分拟通过单因素实验优化转速及离心时间获得最佳离心条件，结果如表3所示。

由表3 可知，嗜热链球菌grx90 细胞存活率随着转速及离心时间的的增加而降低，菌泥获得率随着转速及离心时间的增加而提高。王顺余等[9]在探究冻干条件对于双歧杆菌存活率的影响时观点一致。本实验结果表明，与其他条件相比菌泥获得率总体差距不大，而离心时间为8 min 时，细胞存活率最高。因此选择转速为8 000 r/min、离心时间为8 min 来进行下一步实验。

2.2 保护剂配方优化

醇类属于小分子渗透型保护剂[10]，其亲水能力强且可以透过细胞膜，使细胞中溶质浓度上升从而抑制冰晶生成[11]。因此选取4 种醇类进行单因素实验，以复水后细胞存活率为测定指标，结果如图1所示。

图1 保护剂中醇类的确定及山梨醇含量的确定

由图1（a）可知，山梨醇、甘油、甘露醇对于嗜热链球菌grx90 在冻干过程中细胞损伤具有保护作用。以山梨醇作为保护剂添加剂计算冻干后所得的细胞存活率最高，为55.32%。因此选取山梨醇作为醇类添加物，并对山梨醇进行单因素实验以确定最佳添加量来进行下一步试验。如图1（b）所示，当选取3%浓度山梨醇作为添加物时，冻干后计算所得的细胞存活率最高，为59.66%。因此选择含量为3%山梨醇为醇类的最适添加量。

2.2.2 氨基酸类的优化

根据“玻璃态假说”，高浓度氨基酸分子会发生兼顾固体和流体的状态的玻璃化，黏度极高且难以形成结晶，还存在可形成氢键的功能团，与菌体表面的自由基相互连结避免菌体暴露在介质中[11]。本实验选取谷氨酸钠以及L-半胱氨酸为氨基酸类添加物进行冻干，以复水后细胞存活率为测定指标，结果如图2所示。

图2 保护剂中氨基酸类的确定及L-半胱氨酸含量的确定

由图2（a）可知，添加了谷氨酸钠以及L-半胱氨酸的保护剂与对照组相比，细胞存活率均有所上升。添加了L-半胱氨酸的保护剂冻干后计算细胞存活率为55.43%，因此选用L-半胱氨酸作为保护剂中氨基酸类物质。如图2（b）所示，取0.1%、0.2%、0.3%含量的L-半胱氨酸进行单因素试验，当选取0.2%含量L-半胱氨酸作为添加物时，冻干后计算所得的细胞存活率最高，为56.19%。分析细胞存活率随着L-半胱氨酸的增加先升高后降低的原因可能是氨基酸类与糖类相似，在浓度过高时玻璃化加剧，导致粘度过大、复水效果差。这与Fatemeh 等[12]研究冻干等储存方法对链霉菌代谢的影响时结论一致。因此选择0.2%L-半胱氨酸为盐类的最适添加量以进行下一步试验。

2.2.3 盐类的优化

盐类在菌种冻干过程中一般用于调节体系渗透压以及充当缓冲溶液来中和细菌在冻干过程中的所产生的有机酸。本实验选取3 种盐类保护剂添加物进行冻干，以期复水后获得最大细胞存活率，结果如图3所示。

由图3（a）可知，三种盐类添加物乙酸钠、硫酸锰、氯化钙对于细胞在冻干过程中均有保护作用，其中添加乙酸钠的保护剂细胞存活率最高，因此选取乙酸钠作为盐类的最佳添加物。如图3（b）所示，以0.1%、0.2%、0.3%的乙酸钠进行单因素试验，当选取0.2%乙酸钠作为添加物时，冻干后计算所得的细胞存活率最高，为59.74%，因此选择0.2%乙酸钠为盐类的最适添加量。

图3 保护剂中盐类的确定及乙酸钠含量的测定

2.2.4 糖类的优化

研究发现，当具有黏度的糖类保护剂包围在菌体周围会阻止蛋白质的伸展及沉淀以维持三级结构的稳定性，从而达到保护菌体的目的[7]。因此本实验为了探究不同糖类对菌体的保护作用，添加含量为10%的蔗糖、乳糖、葡萄糖、海藻糖以及果糖为糖类添加物进行保护剂优化实验，结果如图4所示。

由图4（a）可知，添加乳糖、海藻糖的细胞存活率明显优于对照组与其他几种糖类，细胞存活率分别为73.40%及68.83%。这与王琳等[11]报道的在副干酪乳杆菌冻干过程中，筛选双糖类保护剂时乳糖的效果最佳的结论一致。原因可能是由于乳糖不仅具有较高的玻璃化转变温度和稳定的玻璃态性质，还可以与脂双层相互作用，对嗜热链球菌grx90 在冷冻干燥过程中维持细胞膜上的脂质体的物理结构有积极意义。除此之外，乳糖作为保护剂添加物的工业成本远低于海藻糖，因此选取乳糖作为糖类添加物。由图4（b）可知，5%、10%、15%三种不同浓度的乳糖作为保护剂添加物时，10%浓度的乳糖添加量效果最佳，冻干后细胞存活率为71.22%。这与Lee 等人[14]在探究保护剂和复水条件对冻干后的植物乳杆菌发酵能力的影响时结果一致。原因可能是由于10%的乳糖为grx90 提供了最合适的渗透压环境，因此选择浓度为10%的乳糖进行下一步实验。

图4 保护剂中糖类的确定及乳糖含量的确定

2.2.5 正交优化

单一保护剂并不能满足食品工业对发酵剂的要求，因此在冻干过程中一般使用复配保护剂，而复配保护剂中的不同成分在在冻干过程中各自发挥着不同作用，但是却又相互协同[15]。通过正交实验优化保护剂中不同成分的配比并测定细胞存活率，结果如表4所示。

表4 嗜热链球菌grx90保护剂正交优化表

根据表4 可知，最优培养基的配方为A3B1C3D1，即乳糖含量为5%、山梨醇含量为2%、L-半胱氨酸、乙酸钠0.1%。由于得到的最优组合在正交设计中没有，故需要进行验证试验，验证试验的结果为91.37%，优于正交表中最高的第7组的值。

2.3 冻干条件的优化

2.3.1 保护剂与菌体混合比例的优化

菌悬液与冻干保护剂的混合比例也会影响冻干过程中的细胞存活率，当总体积为2 ml 时选取5 种不同比例进行冻干，复水后测定细胞细胞存活率，结果如图5所示。

图5 混合比例的确定

由图5 可知，菌悬液与保护剂的比例过高或过低都会对冻干时的细胞存活率产生不良影响。当菌悬液与保护剂比例为1∶2 时得到最高的细胞存活率为92.01%。当菌悬液与保护剂比例为3∶1 时，由于保护剂浓度过低，导致在冻干过程中，细菌损伤失活现象严重，细胞存活率降低，仅为71.23%。但是加入过多的保护剂，则会降低菌粉的菌体含量，同时在工业生产过程中也加大了生产成本，因此选取1∶2 作为最适混合比例。

2.3.2 装液高度的优化

图6 装液高度的确定

由图6 所知，细胞存活率随着装液高度的增加先增加后减小，在7 mm 时达到最高，为93.49%，随后开始大幅降低，过薄或过厚的装液高度不利于细胞的存活，当装液高度过厚时，细胞无法完全冻干，导致细胞存活率大大降低；而装液高度过低时，保护剂在冻干过程中，脱水速率过快，对细胞膜造成损伤影响存活率，因此选择7 mm 为最适装液高度。

2.3.3 预冻时间的优化

图7 预冻时间的确定

由图7 可知，细胞存活率随着预冻时间的增长先上升后下降，在12 h 时达到峰值，为94.13%。推测原因可能是由于预冻时间过短，温度下降速率过快而导致细胞脱水速率过快，对细胞膜造成损伤，使得细胞存活率过低。预冻过长导致细胞失去生长活性，细胞数量逐渐下降。因此应选取12 h为最适预冻时间。

3 结 论

本实验为提升由江苏省乳制品重点实验室保存的专利菌株嗜热链球菌grx90 在冷冻干燥过程中的细胞存活率，采用单因素实验对冻干过程之前的离心条件进行优化。结果表明，在离心条件为转速8 000 r/min、时间8 min 时细胞存活率最高。其次，利用单因素筛选以及正交优化的实验确定了糖类、醇类、盐类、氨基酸类在脱脂乳保护剂中的最佳添加物及含量分别为5%乳糖、2%山梨醇、0.3%L-半胱氨酸、0.1%乙酸钠。最后探究了冻干条件的对菌体存活率的影响，结果表明菌液与保护剂1∶2 混合装液高度为7 mm，预冻12 h 后对嗜热链球菌grx90 具有显著保护作用，细胞存活率最高。