灵芝孢子油对老龄小鼠抗氧化能力的影响

赵雅欣，郭 豫，胡 芳，肖劲东

（1.北京联合大学功能食品科学技术研究院，北京 100191；2.北京至元世恒医药研究中心，北京 100088）

0 引言

灵芝孢子油提取自灵芝孢子，集灵芝精华，富含灵芝孢子的有效成分，易被人体吸收利用，其保健功效成为一个研究热点[1-3]。现代研究表明，灵芝孢子油富含三萜类化合物、甾醇和不饱和脂肪酸，在神经调节、免疫调节、抗肿瘤、保肝护肝、降血脂等方面具有较高的应用价值，但关于灵芝孢子油抗氧化作用的研究尚且不多[4-5]。此外，相关研究多未表明所用灵芝孢子油的来源，而提取方式也会影响灵芝孢子油的有效成分及功效。有研究人员通过对灵芝孢子油提取方式的研究，发现超临界CO2流体萃取技术在保证安全和提取率的同时，能够最大限度地保留灵芝孢子的活性成分[6-8]。因此，试验利用老龄小鼠模型，采用现代药理学方法，明确使用超临界CO2流体萃取技术进行受试物提取，考查了灵芝孢子油的体内抗氧化作用，旨在为灵芝孢子油在抗氧化方面的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品

灵芝孢子油，浅黄色液体，盐城市大丰葆康源生物科技有限公司提供；选用赤芝（Ganoderma lucidum）的破壁灵芝孢子，采用CO2超临界萃取法提取，三萜含量达15 g/100 g以上。

1.1.2 动物

SPF级8月龄KM种雌性小鼠[许可证号：SCXK-（京）2016-0011]，北京维通利华实验动物技术有限公司提供；维持饲料[许可证号：SCXK（京） 2014-0010]，北京科澳协力饲料有限公司提供。

1.1.3 试剂

8-Isoprostane KIA Kit（酶联免疫试剂盒），Cayman Chemical Company提供；SOD试剂盒、GSH-Px试剂盒、GSH试剂盒、MDA试剂盒、蛋白质羰基试剂盒、双缩脲蛋白试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4 仪器

BS223S型电子天平、BS2202S型电子天平，赛多利斯（上海）贸易有限公司产品，3k15型高速离心机，德国Sigma公司产品；UV2600型紫外可见分光光度计，岛津企业管理（中国）有限公司产品；Elx808型酶标仪，BioTek美国伯腾仪器有限公司产品；SHH.W21.600C型恒温水浴锅，北京市长风仪器仪表公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组与剂量

根据丙二醛的含量随机将小鼠分成3组，每组10只。灵芝孢子油的人体推荐剂量为1.5 g/d（成人体重以60 kg计），小鼠灌胃剂量按人体推荐剂量的10，30倍设置，即设10倍组（250 mg/kgBW）、30倍组（750 mg/kgBW），另设空白对照组。

1.2.2 受试物配制及给予

根据试验剂量，用玉米油稀释灵芝孢子油至适宜浓度（小鼠灌胃体积为10 mL/kgBW），空白对照组以玉米油为受试物，灌胃量相同。每日一次经口给予，连续灌胃40 d。

1.2.3 指标测定

依据国家食品药品监督管理局国食药监保化[2012]107号附件1：抗氧化功能检验方法，进行以下指标的测定，部分方法稍作修改。

（1）小鼠体重的测定。灌胃前后，分别测定小鼠体重并记录。

（2）脂质氧化产物测定。取血0.5 mL于室温下静置10 min，以转速2 000 r/min离心10 min，取上清液待测；采用比色法，严格按照试剂盒的操作说明，测定血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量。

小鼠眼内眦静脉丛取血，以转速3 000 r/min离心10 min。取上清液，用EIA缓冲液稀释15倍备用；严格按照试剂盒的操作说明，测定血清中8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）。

（3）蛋白质氧化产物测定。取0.1 g组织，在冰的生理盐水中漂洗，以去掉表面的血迹。加入0.9 mL冰的10 mmol/L HEPES缓冲液（pH值7.4），制成10%的匀浆。将匀浆液以转速3 000 r/min离心10 min，保留上清液。取100 g/L的硫酸链霉素溶液50μL，加入上清液450μL（V/V，1∶9），室温放置10 min后，以转速11 000 r/min离心10 min，取上清液待测；严格按照试剂盒的操作说明，测定肝组织中蛋白质羰基。

（4）抗氧化酶活力测定。严格按照试剂盒的操作说明，测定红细胞抽提液中超氧化物歧化酶（SOD）活力；严格按照试剂盒的操作说明，测定全血谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力。

（5）抗氧化物质测定。取组织0.5 g加生理盐水4.5 mL充分研磨成细浆（10%肝匀浆），混匀后取浆液0.5 mL加4%磺基水杨酸0.5 mL混匀，在室温下以转速3 500 r/min离心10 min，取上清液备用。严格按照试剂盒的操作说明，测定肝组织中还原型谷胱甘肽（GSH） 含量。

1.3 数据处理

利用SPSS软件统计、分析数据，试验数据全部表示为X±s，采用t检验进行组间比较，以p＜0.05为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 试验前小鼠血清丙二醛含量

给予受试物前小鼠血清MDA含量及给予受试物前后小鼠体重的变化情况见图1。

图1 给予受试物前小鼠血清MDA含量及给予受试物前后小鼠体重的变化情况

由图1可知，试验前各剂量组老龄小鼠血清丙二醛含量与对照组比较，差异均无显著性（p＞0.05）。小鼠分组的科学性直接影响试验结果的可靠性，故选用专业机构培育的试验小鼠，并遵循随机分组原则，在试验前通过测定各组小鼠的血清MDA值来确定分组的科学性。由检测结果可知，给予灵芝孢子油前老龄小鼠血清丙二醛含量在各组间较为均衡，符合随机分组要求，具有分组科学性。

2.2 对小鼠体重的影响

由图1可知，经口给予老龄小鼠灵芝孢子油前及给予灵芝孢子油40 d后体重在各剂量组与对照组比较，差异均无显著性（p＞0.05）。小鼠体重是小鼠是否健康的一个最基础、最重要的衡量指标。给予受试物前小鼠体重无显著性差异，表明小鼠分组合理；给予受试物后各组小鼠体重无显著性差异，说明该受试物对老龄小鼠的体重无不良影响，可推断出该受试物不会对小鼠健康带来不良影响，一定程度上说明灵芝孢子油具有较好的食用安全性。

2.3 对小鼠脂质氧化产物含量的影响

灵芝孢子油对小鼠血清MDA，8-Isoprostane含量的影响见图2。

图3 灵芝孢子油对小鼠肝组织蛋白质羰基含量的影响

图2 灵芝孢子油对小鼠血清MDA，8-Isoprostane含量的影响

由图2可知，经口给予老龄小鼠不同剂量的灵芝孢子油40 d后，与对照组比较，高剂量组小鼠血清MDA含量降低，有显著差异（p＜0.05）；小鼠血清8-Isoprostane含量无明显变化（p＞0.05）。血清MDA和8-Isoprostane都是表明小鼠脂质氧化产物的指标，但试验中出现了MDA含量降低但8-Isoprostane含量无明显变化的情况，即灵芝孢子油在750 mg/kgBW剂量水平能降低老龄小鼠血清中的丙二醛含量，但灵芝孢子油对小鼠血清8-表氢氧-异前列腺素含量无显著影响。这可能与2个指标的敏感性有关，在灌胃40 d后小鼠血清MDA含量降低，也许更长时间才会引起小鼠血清8-Isoprostane含量的降低。赵灏等人[9]探讨了灵芝孢子油对大鼠肝纤维化的影响，发现灵芝孢子油可显著降低大鼠血清中MDA含量，与研究结果一致，说明灵芝孢子油具有降低体内MDA含量的能力。

2.4 对小鼠蛋白质氧化产物含量的影响

灵芝孢子油对小鼠肝组织蛋白质羰基含量的影响见图3。

由图3可知，经口给予老龄小鼠不同剂量的灵芝孢子油40 d后，与对照组比较，高剂量组小鼠肝组织蛋白质羰基含量降低，有显著差异（p＜0.05）。一些氧自由基会氧化蛋白质的氨基酸侧链，导致机体内羰基产物的积累；一些自由基甚至会导致肽链断裂，破坏蛋白质的一级结构，同样会产生蛋白质羰基。具有羰基的蛋白质会聚集、交联，从而失去应有的活性，因此蛋白质羰基含量是蛋白质氧化程度的一个重要指标。灵芝孢子油能够降低小鼠肝组织蛋白质羰基含量，这与灵芝孢子油较强的抗氧化能力有关，说明其抗氧化作用能够减少机体蛋白质的氧化。结果表明，灵芝孢子油在750 mg/kgBW剂量水平能降低老龄小鼠肝组织中的蛋白质羰基含量，有助于减缓机体的过氧化作用。灵芝孢子油使得老龄小鼠血清中的蛋白质羰基的水平显著降低，可以有效阻止一些自由基对蛋白质的氧化作用；其他文献中对灵芝孢子油和蛋白质羰基的关系研究尚少。

2.5 对小鼠抗氧化酶活力的影响

灵芝孢子油对小鼠血中SOD和GSH-Px活力的影响见图4。

图4 灵芝孢子油对小鼠血中SOD和GSH-Px活力的影响

由图4可知，经口给予老龄小鼠不同剂量的灵芝孢子油40 d后，与对照组比较，低、高剂量组小鼠血清SOD活力和GSH-Px活力均无明显升高（p＞0.05）；即灵芝孢子油对老龄小鼠的血清过氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽过氧化物酶活力无显著影响。SOD和GSH-Px是2种机体很重要的抗氧化酶，其活力高低标志着机体抗氧化能力的强弱，给予灵芝孢子油后老龄小鼠的抗氧化酶活力并未提高，说明灵芝孢子油不能通过提高酶活力的方式来实现抗氧化作用。胡瞬等人[10]研究了灵芝孢子油对小鼠衰老模型的抗氧化作用，结果表明灵芝孢子油可显著提高衰老小鼠血液中的过氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶活性。江红梅等人[11]对辐射损伤老龄小鼠模型的研究也表明，灵芝孢子油对小鼠血液红细胞的SOD活力有显著提高的作用。但研究中，灵芝孢子油没有显著提高老龄小鼠的SOD活力，这可能与动物模型、灌胃剂量等有关，胡瞬、江红梅等人[10-11]选用的最大灌胃剂量均大于研究。

2.6 对小鼠肝组织还原型谷胱甘肽含量的影响

灵芝孢子油对小鼠肝组织还原型谷胱甘肽含量的影响见图5。

由图5可知，经口给予老龄小鼠不同剂量的灵芝孢子油40 d后，与对照组比较，肝组织GSH含量无明显升高（p＞0.05）；即灵芝孢子油对老龄小鼠的肝组织还原型谷胱甘肽含量无显著影响。还原型谷胱甘肽是肝组织中重要的抗氧化物质，灵芝孢子油未能显著提高其含量，说明灵芝孢子油不能通过提高肝组织还原型谷胱甘肽含量而间接地起到防止机体过氧化的作用。陈体强等人[12]不仅研究了灵芝孢子油中的脂溶性维生素，而且研究了灵芝孢子油的抗氧化作用，发现灵芝孢子油有明确的抗氧化活性。灵芝孢子油抗氧化的机理还可以做更进一步的研究。

3 结论

灵芝孢子油能显著降低老龄小鼠的血清MDA含量和肝组织蛋白质羰基的水平，说明灵芝孢子油能够减少小鼠体内的脂质氧化产物和蛋白质氧化产物，具有显著的抗氧化作用。但是，灵芝孢子油并不能有效提高小鼠体内抗氧化酶和抗氧化物质的活力或含量，这说明灵芝孢子油应该是直接跟氧自由基等活性氧作用，从而保护机体脂质和蛋白质不被氧化，实现抗氧化作用。关于灵芝孢子油与其抗氧化作用的量效关系及确切机制，还有待更进一步研究。