烟曲霉多糖合成酶Cps1敲除菌株的构建及其鉴定

徐宁洁， 王凯杰， 周哲伦， 杨马炯， 王 莎

(湖州师范学院 医学院， 浙江 湖州 313000)

0 引 言

侵袭性曲霉病是一种临床上常见的肺部侵袭性感染性疾病，主要以曲霉菌侵入肺组织并引起深部真菌感染为特征[1].近年来由于广谱抗生素、糖皮质激素及免疫抑制剂等药物的广泛使用，器官移植的开展，以及免疫缺陷病如艾滋病病人增多等，曲霉病患者的数量急剧上升[2].烟曲霉是侵袭性曲霉病的主要致病原，其产孢数量大，被吸入肺部后常定植在局部，对于免疫功能健全的个体而言，可通过自身的免疫细胞清除被吸入的孢子，但当机体免疫力低下或免疫功能受损时即可引起感染，并随血液循环到达全身其他器官引起严重的疾病，甚至死亡.

烟曲霉作为一种重要的人类致病性丝状真菌，其细胞壁发挥着关键而复杂的作用，以维持其细胞形状来适应恶劣环境.烟曲霉的细胞壁主要由多糖骨架和多种糖蛋白构成，其中多糖含量达90%以上，包括几丁质和β-葡聚糖两种主要成分[3].此外，细胞壁可介导宿主细胞对真菌的识别和摄取，刺激宿主免疫应答并调节宿主代谢途径.烟曲霉的细胞壁对维持菌体本身生长和入侵宿主细胞都具有重要作用，是一种重要的毒力因子，并且参与细胞壁整合途径的蛋白在哺乳动物中很少有同源蛋白或同源性很低，因此对真菌细胞壁及其重要组分功能的研究具有重要意义.研究报道，在一些真菌和细菌中，cps基因参与了细胞壁完整性的合成途径，在荚膜多糖的合成中起关键性的调节作用[4].该基因作为烟曲霉的新基因，被预测为多糖合成酶(capsule polysaccharide synthase Cps1,putative)，其在烟曲霉中的功能并没有被研究.本实验采用Fusion PCR方法敲除cps1基因来探究该基因在烟曲霉中的功能.

1 实验材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

转化受体菌株是烟曲霉A1160(ΔKu80;pyrG)，该菌具有尿苷、尿嘧啶营养缺陷，并已去除非同源重组nku基因，有利于进行外源片段的同源重组.质粒pAL5购买于真菌保藏中心FGSC，以此质粒为模板，扩增出pyr4营养筛选片段，作为筛选转化子时所需的营养标记，以弥补转化受体菌株尿苷、尿嘧啶营养缺陷.

1.1.2 培养条件

培养基有YAG培养基(含2%葡萄糖、0.5%酵母膏提取物、1 mL/L Trace elements、2% Agar)和YUU培养基(YAG培养基中添加5 mM尿嘧啶和10 mM尿苷)，其中YAG培养基用于筛选转化子.

1.1.3 仪器与试剂

Bio-Rad T100 PCR仪由Thermo Scientific生产；全自动CCD凝胶成像分析仪由上海培清科技有限公司生产；DYY-7C型电泳仪由北京市六一仪器厂生产.

高保真DNA聚合酶购自南京诺唯赞生物技术有限公司；切胶回收试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；相关细胞壁酶购自Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1 融合PCR引物的设计

用于构建融合片段的引物与一般引物有所区别，其引物的设计是融合PCR顺利进行的一个关键步骤.其中，引物cps1 P1、cps1 P3和cps1 P4、cps1 P6分别用来扩增cps1基因的上游和下游同源臂，引物cps P2和cps P5用于融合PCR，将3个片段连成用于转化的线性片段.融合PCR引物设计原理见图1(cps1 P3、cps1 P4引物下划线部分为与pyr4片段重叠的接头部分).

引物具体序列如下：

cps1 P1 TATTTTTGTTCCATTTGATT;

cps1 P2 ACCGCTGCCAATCCTGTCTC;

cps1 P3 GGCTTGTCTGCTCCCGCAACGAAGTTTCCTTGCTAT;

cps1 P4 ACGCCAGGGTTTTCCCCCCCAACTTCATAACTCAAT;

cps1 P5 CGACGAAAGCAATGAACAAG;

cps1 P6 AAATCAACCATGGATCAGAC;

pyr4 F TGGCGTTACCCAACTTAATCG;

pyr4 R GCTTTCGGGAACTGGCTACTTAT;

Diag-cps1 AGTTCGTCACCACATCCCTC;

Diag-pyr4R TGTCAACATCAAGGGCAC.

1.2.2 左右同源臂和营养筛选片段的合成

PCR反应体系：以野生型的基因组DNA为模板，上游引物cps1 P1和下游引物cps1 P3扩增烟曲霉cps1基因编码区上游侧翼片段，上游引物cps1 P4和下游引物cps1 P6扩增烟曲霉cps1基因编码区下游侧翼片段，上游引物pyr4 F和下游引物pyr4 R扩增营养筛选片段pyr4.PCR 使用的DNA聚合酶为高保真酶，扩增后的产物片段再用切胶回收试剂盒进行纯化.

扩增左右同源臂和营养筛选片段的PCR步骤：①95 ℃ 2 min；②95 ℃ 25 s；③ 56 ℃ 25 s；④ 72 ℃ 40 s；⑤go to step 2 for 36 times；⑥72 ℃ 10 min；⑦ 4 ℃ for ever.

1.2.3 采用融合PCR获得同源转化片段

PCR反应体系：模板包括3部分，即cps1的左右同源臂和中间的营养筛选片段pyr4，扩增引物是nested primers(cps1 P2 + cps1 P5)，将上述3个片段融合成一条线性片段，没有选用cps1 P1和cps1 P6进行扩增主要是为避免非特异性扩增，并提高扩增的质量.另外，为使3个片段顺利融合成一个长的整合片段，本文在设计P3和P4引物时，各自携带了pyr4片段接头处的序列，以便在融合PCR运行过程中将3个片段的序列依次连接进行扩增.

PCR步骤：①94 ℃ 2 min；②94 ℃ 20 s；③ 70 ℃ 1 s；④ramp to 55 ℃ at 0.1 ℃/s；⑤55 ℃ 30 s；⑥ramp to 68 ℃ at 0.2 ℃/s；⑦68 ℃ 4 min；⑧go to step 2 for 10 times；⑨94 ℃ 20 s；70 ℃ 1 s；ramp to 55 ℃ at 0.1 ℃/s；55 ℃ 30 s；ramp to 68 ℃ at 0.2 ℃/s；68 ℃ 4 min incredement 5 s/cycle；go to step 9 for 5 times；94 ℃ 20 s；70 ℃ 1 s；ramp to 55 ℃ at 0.1 ℃/s；55 ℃ 30 s；ramp to 68 ℃ at 0.2 ℃/s；68 ℃ 4 min incredement 20 s/cycle；go to step 16 for 10 times；4 ℃ for ever.

1.2.4 转化

烟曲霉A1160菌株为转化的受体菌株，使用细胞壁酶水解已萌发出短芽管的孢子，酶解3 h后得到原生质体，再将之前获得的融合PCR产物片段转化到原生质体中，混合均匀后倒入筛选培养基YAG中进行培养，37 ℃培养2天左右可长出相关菌落，即为转化子.

1.2.5 纯化并筛选基因敲除菌株

用牙签将转化子在YAG培养基上划线分离单菌落，培养2天，取与野生型有明显差别的菌落再次做划线分离，纯化3次得到的单一菌落为敲除菌株的候选者.

1.2.6 诊断PCR进行菌株鉴定

提取野生型菌株A1160和转化子的基因组DNA为诊断PCR的模板，设野生型菌株DNA作为对照样本.诊断PCR引物为两对，其中上游引物cps1-P1和下游引物Diag-cps1可以扩增cps1基因的自身条带，引物cps1-P1和Diag-pyr4用于鉴定转化子中cps1自身片段是否已被pyr4所替换.若Δcps1转化子中，用cps1-P1和Diag-pyr4能扩增出特异性片段，同时并不能扩增出自身条带，即可鉴定该菌株为cps1基因敲除菌株.

1.2.7 产孢计算

将野生型A1160和Δcps1菌株分别接种在两个独立的YUU平板上，37 ℃培养2天后，用0.02% Tween80收集固体培养基上的孢子，用无菌水冲洗2遍，血球计数板计数，得到相应孢子的总数量，再除以之前测得的菌落面积，即得到对应的产孢量.

2 结 果

2.1 左右同源臂及中间片段扩增结果的检测

以野生型菌株DNA为模板，在高保真DNA聚合酶的作用下，通过引物cps1 P1/P3和cps1 P4/P6扩增敲除基因cps1的左同源臂和右同源臂片段，电泳结果显示片段大小分别为864 bp和907 bp，与预计长度一致，如图2所示.另外，使用引物pyr4F/pyr4R从质粒pAL5中扩增用作营养筛选标记的中间片段pyr4，电泳结果显示与预期大小一致，片段长度为2 272 bp.

2.2 融合片段扩增结果的检测及其转化

以cps1基因的左同源臂、右同源臂以及pyr4营养筛选片段为融合PCR的模板，使用引物cps1 P2/ P5，通过高保真DNA聚合酶的扩增作用将上述3个片段进行连接融合.融合PCR结束后将获得的融合片段产物进行切胶回收，后经电泳鉴定，结果显示该融合片段大小为3 868 bp(图3)，与预计大小一致，表明融合片段构建成功.之后，再将切胶回收后约5 μg的融合片段通过转化方法转入烟曲霉A1160的原生质体中.

2.3 Δcps1敲除菌株诊断PCR验证结果

对于后期筛选出来的转化子，为了确定菌株中的cps1基因片段是否被pyr4片段取代，本文采用诊断PCR对菌株进行鉴定.首先分别提取野生型菌株和Δcps1转化子菌株的DNA作为模板，其中野生型菌株为对照样本，并使用两对诊断引物进行鉴定，如图4所示.泳道1和3：PCR扩增引物为cps1-p1和Diag-cps1，上游引物cps1-p1结合于cps基因起始密码子上游区域，下游引物Diag-cps1结合于cps1基因编码区域，用于检测cps1是否仍然存在于基因组中，扩增片段预期大小为1 129 bp；泳道2和4：PCR扩增引物是cps1-p1和Diag-pyr4，下游引物Diag-pyr4结合于营养筛选标记pyr4片段的中间区域，用于检测营养筛选片段pyr4是否替换了cps1基因.由诊断PCR结果可知，野生型菌株已成功扩增出1 129 bp的cps1基因自身片段，而Δcps1菌株并没有扩增出自身片段，但已扩增出1 496 bp的鉴定片段，说明该转化子已经成功敲除了cps1基因的编码区域，即烟曲霉cps1敲除菌株构建成功.

2.4 菌株的表型特征

为了确定cps1基因敲除后是否会影响菌株的表型，将野生型菌株(A1160)和Δcps1菌株接种于YUU培养基上，37 ℃培养2天后观察，如图5A所示，野生型菌落直径大，且菌落较为舒展，中间出现大量绿色的孢子，而Δcps1菌落直径变小，显示出紧密而褶皱的表型，肉眼几乎看不到绿色的孢子.为进一步确定cps1基因对产孢功能的影响，本文分别对菌落中产生的孢子数量进行定量计数检测，结果如图6B所示，野生型菌株的产孢量为(1.47×108±6.1×106)/ cm2，而Δcps1菌株的产孢量是野生型的2.9%，只有(4.28×106±4.36×105)/ cm2，表明其产生分生孢子的能力几乎完全缺失.该计数值是3次独立实验的平均值±SD(P<0.01)，敲除株与对照组(WT)的产孢量相比差异非常显著.

3 讨 论

对于存在于自然界的各种真菌而言，无性孢子的产生是它们最普遍的繁殖方式.由于真菌主要通过产生分生孢子进行繁殖，因此，控制它们产孢可以有效地降低真菌的危害性.烟曲霉的孢子产量非常大，在环境中无处不在，由于其体积小，生长速度快，对外界不良环境有很大的耐受性，且吸附能力强，容易通过呼吸道发生侵入性感染.而侵袭性曲霉病的发病机制主要是由散布在空气中的孢子通过呼吸道吸附定植在肺中，后期通过菌丝侵袭性生长侵入肺实质引起肺部感染[5].一般来说，曲霉侵袭力的强弱在一定程度上是由孢子的扩散和侵袭能力等决定的.

细胞壁结构的完整性是丝状真菌形态建成的重要环节，并对菌丝的生长、分生孢子的产生及其毒力起到至关重要的作用.本实验研究的Cps1同源蛋白存在于大多数真菌和一些细菌中，并在体内发挥重要作用.研究表明，新生隐球菌的cps1基因编码透明质酸合成酶，负责合成荚膜的主要成分透明质酸.进一步研究发现，cps1敲除后在菌株中检测不到荚膜HA，且对人脑微血管内皮细胞的粘附率和侵袭率有明显降低的趋势[6]，表明该蛋白在新生隐球菌的侵袭过程中起到了关键作用，也是重要的毒力因子.而在粗糙脉孢菌的同源蛋白研究中发现其与细胞壁整合和蛋白镶嵌有关，缺失菌株细胞壁不完整且细胞壁蛋白大量丢失[4].此外，cps1基因在小鼠脑、心脏、脾脏、肝脏、肾、小肠、睾丸等组织器官都有表达，Cps1是尿素循环的第一个限速酶[7]，在机体解毒氨中起着重要作用，在肝细胞癌中发生了下调，同时通过干扰cps1的表达发现细胞的增殖活性受到抑制，细胞出现了凋亡，说明cps1基因在细胞中的作用也尤为重要.

本研究通过对菌株的鉴定成功构建了烟曲霉cps1敲除菌株，这是研究多糖合成酶Cps1在烟曲霉中功能的第一步，同时通过对表型初步的观察发现,cps1基因的缺失后导致其菌落面积变小，形态呈褶皱状，孢子形成严重缺陷(图6).而菌落面积的减小说明cps1基因的缺失影响了菌丝生长的速度，同时分生孢子的严重缺失也使其毒力大大下降.总之，相比野生型菌株，cps1基因敲除后，影响了烟曲霉的生长和产孢功能，使其致病性在一定程度上减弱，这为临床上控制曲霉病的感染及改进现有治疗策略提供了新思路.

据报道，几丁质水平的降低会使分生孢子的产生受到抑制[8]，同时考虑到真菌细胞壁及其相关重要组分功能的研究对于认识微生物的生理代谢过程、与宿主的互作以及作为潜在靶点设计药物都具有重要意义，而多糖合成酶Cps1敲除后，又将如何影响烟曲霉细胞壁组分的构成情况，这是一个比较有意义的研究方向.后期我们拟检测多糖合成酶Cps1对烟曲霉细胞壁结构和组分的影响及其在活细胞体内的定位，重点检测细胞壁组分如几丁质和葡聚糖含量的变化情况，从而详细阐明Cps1在烟曲霉细胞壁多糖合成及其整合中的作用.