Box-Behnken响应面法优化红叶石楠花色苷提取工艺的研究

2020-04-23郭雅丽程玉蕾徐丹宁徐伊铭

湖州师范学院学报 2020年2期

肖莉，郭雅丽，程玉蕾，王易，徐丹宁，徐伊铭，张邈

(湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000)

红叶石楠为蔷薇科石楠属杂交种的统称，其新梢和嫩叶含有大量的功能性色素，主要成分为花色苷.临床研究表明，花色苷具有抗氧化、减少血浆胆固醇、改善血糖、抗炎、心脏保护、肝保护、抗诱变和抗癌等保健功能，可作为功能保健食品的原料，具有较高的经济价值[1-2].目前对红叶石楠花色苷的研究集中于园林技术，关于花色苷提取方法及工艺优化的研究还不够全面.笔者采用超声波辅助法，对在红叶石楠叶中提取花色苷的工艺技术进行研究.该研究在单因素实验的基础上，利用Box-Behnken 响应面法优化提取工艺，旨在为红叶石楠花色苷资源的综合利用提供参考[3-4].

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料与试剂

红叶石楠叶，2019年4月采于湖州师范学院东校区；无水乙醇、盐酸、氯化钾、醋酸钠等为国产分析纯.

1.1.2 主要仪器与设备

UV1900PCRT双光束紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)、756 CRT紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、高速多功能粉碎机(上海舍岩仪器有限公司)、抽滤真空泵(郑州长城科工贸有限公司)、pH计(上海雷磁仪器有限公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)、超声波清洗器(上海阁凌工业清洗设备有限公司)、电子分析天平(Mettler Toledo公司).

1.2 方法

1.2.1 样品处理

采摘后的红叶石楠叶经清洗、自然晾干后，置于真空干燥箱内干燥24 h，取出粉碎，过60目标准筛，在干燥密闭条件下贮存备用.

1.2.2 红叶石楠花色苷的提取

准确称取5.00 g红叶石楠叶样品，按比例加入一定浓度的乙醇溶液，在一定的温度下进行超声提取，经4 500 r/min离心20 min，取上清液备用.

1.2.3 缓冲液的配制[5]

pH 值为1.0缓冲剂的配制：0.2 mol/L的氯化钾∶0.2 mol/L的盐酸(25∶67 V/V).

pH 值为4.5缓冲剂的配制：1 mol/L醋酸钠∶1 mol/L的盐酸∶水(100∶60∶90 V/V/V).

1.2.4 花色苷最大吸收波长的测定

准确量取5 mL提取液两份，分别用pH 1.0和pH 4.5缓冲溶液稀释定容至25 mL，静置90 min，利用紫外可见分光光度计在200～700 nm之间分别对提取的原液在pH 1.0和pH 4.5的新鲜红叶石楠叶提取液中扫描检测，确定最大吸收波长(λmax).

1.2.5 花色苷含量的测定

采用pH示差法测定红叶石楠花色苷含量.分别测定两份溶液在λmax和λ(700 nm)处的吸光度值，计算△A，根据公式(1)、(2)计算样品中花色苷含量.

△A=(Aλmax-A700 nm)pH1.0-(Aλmax-A700 nm)pH4.5，

(1)

花色苷含量(mg/g)=(△A/εL)×M×V×F/W×100.

(2)

式中：ε为矢车菊-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数，为26 900 L/(mol·cm)；M为矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量449.2 g/mol；V为最后定容的体积mL；F为稀释倍数；M为样品质量(g)；L为比色皿的宽度(1 cm).

1.3 单因素实验设计

1.3.1 料液比对提取率的影响

称取5份样品粉末(每份5 g)，分别以料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)加入50%乙醇，在50 ℃下超声提取1次，超声时间为30 min.

1.3.2 提取时间对提取率的影响

称取5份样品粉末(每份5 g)，以料液比为1∶20(g∶mL)加入50% 乙醇，在50 ℃条件下超声提取1次，超声时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min.

1.3.3 提取温度对提取率的影响

称取5份样品粉末(每份5 g)，以料液比为1∶20(g∶mL)加入50%乙醇，以50%乙醇为提取剂，料液比为1∶20(g∶mL)，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下超声提取1次，超声时间为30 min.

1.3.4 溶剂浓度对提取率的影响

称取5份样品粉末(每份5 g)，分别以30%、40%、50%、60%、70%的乙醇为提取剂，料液比为1∶20(g∶mL)，在50 ℃条件下超声提取1次，超声时间为30 min.

1.3.5 提取次数对提取率的影响

称取3份样品粉末(每份5 g)，以50%乙醇为提取剂，料液比为1∶20(g∶mL)，在50 ℃条件下分别超声提取1次、2次、3次，超声时间为30 min.

1.4 响应面试验设计

在单因素实验基础上，在固定提取温度50 ℃和提取次数1次的条件下，选取乙醇浓度、料液比和提取时间3个因素为自变量，由红叶石楠叶中提取的花色苷含量为指标，设计3因素3水平的Box-Behnken试验，对红叶石楠花色苷超声提取工艺进行优化.试验因素和水平编码见表1[6-8].

表1 响应面因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对红叶石楠花色苷提取的影响

由图1数据可以看出，在料液比低于1∶5时，随料液比的增加，花色苷的提取率逐渐增大.当料液比达到1∶15时，花色苷的提取率达到最大值9.05 mg/g.进而继续增加料液比，花色苷的提取率出现明显的下降趋势.这是由于料液比的增加虽然提高了花色苷的溶出，但相应也会稀释花色苷的浓度，从而降低了提取液中花色苷的含量.

2.1.2 提取时间对红叶石楠花色苷提取的影响

由图2数据可以看出，随着提取时间的延长，花色苷的提取率逐渐增加，提取时间为30 min时，达到最大提取率9.25 mg/g.进一步延长提取时间，花色苷提取率反而降低，其原因可能是因为长时间超声加热破坏了部分花色苷的结构.

Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanin Fig.2 Effect of time on the extraction rate of anthocyanin

2.1.3 提取温度对红叶石楠花色苷提取率的影响

由图3数据可以看出，当提取温度在30～50 ℃时，随着温度的提高花色苷提取率随之升高.超过50 ℃后上升趋势下降,其原因可能是过高的温度导致部分花色苷结构被破坏.因此选择50℃为最佳提取温度.

Fig.3 Effect of temperature on the extraction rate of anthocyanin

2.1.4 溶剂浓度对红叶石楠花色苷提取率的影响

由图4数据可以看出，随着溶剂浓度的增加，红叶石楠花色苷提取率逐渐升高；当乙醇体积分数为50%时，花色苷提取率达到最大，为9.32 mg/g；继续提高乙醇体积分数，花色苷提取率反而下降,其原因可能是花色苷类物质极性较强，当提取溶剂极性较大时，虽然有利于花色苷的溶出，但同时也有多糖类杂质的溶出，导致提取溶液体系变黏稠，从而抑制了花色苷的溶出.

2.1.5 提取次数对红叶石楠花色苷提取率的影响

由图5数据可以看出，随提取次数的增加花色苷提取率升高，但升高并不明显.因此从实验效果与成本等方面考虑，确定最佳提取次数为1次.

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计和方差分析

采用Box-Behnken实验设计原理，建立料液比(A)、提取时间(B)和溶剂浓度(C)3因素3水平的响应面试验模型.实验安排和实验结果见表2.

表2 Box-Behnken响应面实验设计与结果

以花色苷含量(mg/g)为指标(R1)，采用Design-expert 8.0.6软件对响应值与各因素进行回归拟合，得到的回归方程为：

R1=10.65-0.77A+0.023B+0.21C+0.38AB+0.25AC+0.5BC-2.07A2-1.95B2-2.76C2.

注:*为P<0.05;**为P<0.01;***为P<0.001.

2.2.2 交互作用对花色苷提取率的影响

相对3个单因素中其中的2个因素，通过Design-expert软件绘制三维响应面图，进一步分析各因素交互作用对花色苷提取率的影响.响应面的平缓程度直观地反映出各自变量发生变化时花色苷提取率的响应灵敏度.

Fig.6 Response surface showing the interactions of two factors on the extraction rate of anthocyanin

图6中的三维效应面可以反映出料液比(A)、提取时间(B)和溶剂浓度(C)的交互作用对红叶石楠花色苷提取率的影响.AB、AC、BC的曲面坡度较为平缓，故其对红叶石楠花色苷提取率的影响不显著，与方差分析结果一致.

2.3 最优方案的验证

设置花色苷提取率目标值为最大值，通过Design-Expert软件分析得到的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度为50.6%，料液比为1∶14.05，提取时间为29.9 min，50 ℃下提取1次，花色苷的理论提取率为10.73 mg/g.考虑到实验的可操作性，最终确定最佳的提取工艺参数为：乙醇浓度为51%，料液比为1∶14，提取时间为30 min，50 ℃下提取1次.按此工艺重复3次，得到的花色苷提取率为10.81 mg/g，实测值与预测值差别不大，说明该工艺稳定可靠.