推拿疗法对骨骼肌纤维化大鼠MMP-1和TIMP-1表达的影响*

庞 赓，李 沙，唐新月，赵 娜

（1.天津中医药大学，天津 301617；2.天津体育学院，天津 301617；3.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193）

急性骨骼肌损伤作为运动性损伤的一种类型，一直呈高发态势，其致病原因多为钝挫伤或牵拉伤。虽然已有研究证实骨骼肌损伤后具有再生修复的能力，但严重的钝挫伤可导致骨骼肌纤维断裂、肌膜遭到破坏、肌核死亡，使其丧失再生功能，这时结缔组织增生，瘀痕修复占据主导，骨骼肌出现纤维化[1]。骨骼肌纤维化可导致肌肉弹性不同程度的消退、功能受损、运动能力下降，且具有不可逆性，因此抗纤维化的治疗手段一直都是运动医学领域研究的热点。研究显示，由于致炎细胞的持续浸润，成肌细胞可转型为肌成纤维细胞，其过度活化增殖产生大量细胞外基质，导致的大量胶原纤维持续聚集，是骨骼肌纤维化的重要环节[2]。研究发现基质金属蛋白酶（MMPs）/金属蛋白酶组织抑制因子（TIMPs）的动态平衡对细胞外基的合成与降解具有调节作用[3]。

推拿作为一种绿色、无化学毒副作用的治疗方法，针对骨骼肌的各种损伤具有明显的临床疗效[4]，本研究通过复制大鼠急性骨骼肌钝挫伤模型，选用临床推拿核心手法——按揉法为干预手段进行治疗，观察其对骨骼肌纤维化的干预效果，并阐明其机制是否与调控基质金属蛋白酶-1（MMP-1）/金属蛋白酶组织抑制因子-1（TIMP-1）平衡相关。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠 20只，体质量（200±20）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证编号SCKY（京）20140004饲养于天津中医药大学清洁级动物房。

1.1.2 实验仪器和主要试剂 TPA-Ⅱ推拿手法测定仪（上海益联医学仪器发展有限公司）；Veriti PCR热循环仪、荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；PowerPac Basic基础电泳仪、凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）；cDNA第一链合成试剂盒、SYBR Green试剂盒（天津彬彤生物科技有限公司）；兔抗大鼠多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；BCA蛋白检测试剂盒（美国Thermo公司）；低速离心机，型号LDZ5-2（北京京立离心机有限公司）。

1.2 骨骼肌钝挫伤模型的复制和分组 本研究效仿经典钝挫伤造模法[5]，自制造模装置，选取SD大鼠腓肠肌部位为造模区域，以重物垂直下落方式击打造模，具体操作如下：动物入笼适应性喂养一周后，调配10%水合氯醛（0.4 mL/100 g），一次性腹腔注射麻醉；选取大鼠右后肢内侧面，距根骨1.5 cm处为造模区域，标注，备皮；将大鼠仰卧位固定于操作台上，右后肢外展，伸膝、踝背屈90°，充分暴露标记部位；将面积为1 cm2的圆形接触装置紧贴大鼠标记部位，固定；220 g重物由81 cm高度下落垂直击打接触装置，动能2.62 J；将创面无破损、无骨折，击打部位为标记区大鼠入组，完成造模。参阅文献，该造模方式制备纤维化大鼠模型达100%。成模大鼠观察3 d后，依体质量遵数字随机法分为模型组和推拿干预组（n=10）。

1.3 干预措施 选用TPA-Ⅱ推拿手法测定仪采集并储存推拿名家王金贵教授手法参数，建立量化标准；实操人员依标准进行模拟训练，后经测定仪评定，实操人员在力度、频率与量化标准一致后方可进入实验组干预。成模后3日后，依量化标准实施干预，具体操作流程如下：缚成模大鼠于自制固定装置，仰卧位，暴露患肢；定位大鼠患处及周边，依标准按揉施术；固定时间、每天10 min/次、25 d连续施术。

模型组：参照推拿组相同方式予以固定，不施加干预，10 min/次/d，连续 25 d。

1.4 标本采集与处理 经25 d干预后，大鼠称质量后调配10%水合氯醛（0.4 mL/100 g），一次性腹腔注射麻醉，立即解剖并分离大鼠腓肠肌中段，均分为2份，一份用于苏木精-伊红（HE）染色；另一份用锡纸包裹后置于-80℃冰箱保存，用于后续qPCR及Western Blot检测。

1.5 HE染色 操作步骤：将腓肠肌组织置于4%甲醛固定72 h，改刀，石蜡包埋，4 μm切片，常规脱蜡至水，置于苏木精液中染色5 min，流水冲洗5min，1%盐酸乙醇分化3 s，稍后流水浸泡10 min，置入蒸馏水中5 min，经伊红染色2 min，梯度酒精脱水，放入二甲苯中透明，最后用中性树胶予以封固。镜下观察各组大鼠腓肠肌形态结构变化。

1.6 实时荧光定量核酸扩增（qPCR）检测大鼠腓肠肌MMP-1、TIMP-1mRNA表达情况 取大鼠造模区域腓肠肌组织样品，加入1 mL Trizol试剂与氯仿分离，经4℃以下7 000 rpm转速震荡离心后取出上清液；加入异丙醇经振荡离心后去除上清液，经75%乙醇洗涤后再次去除上清液，常温干燥，加入DEPC，随即测量RNA的浓度与纯度。从Genbank数据库查找出MMP-1及TIMP-1的mRNA序列，参照说明书逆转录反应合成cDNA，用SYBR Green法冰上配制20 μL反应液进行扩增，具体反应条件如下：95℃15 min，预变性及热启动→95℃10 s，变性→60℃30 s，退火→72℃1 min，延伸→40个循环。所得数据用2-ΔΔCT法计算各基因的相对表达量。具体的引物序列如：MMP1引物设计，上游引物5'-TACCATC-CTGCGACTCTTGC-3'，下游引物为：5'-TTCACCCA-CATCAGGCACTC-3'。TMIP1 引物设计，上游引物：5'-ACACCCCAGTCATGGAAAGC-3'，下 游 引 物 ：5-'AAGAA GCTGCAGGCACTGAT-3'；GAPDH引物设计，上游引物：5'-AAGAAGGTGGTGA AGCAGG-3'， 下游引 物 ：5'-GAAGGTGGAAGAGTGGGAGT-3'。

1.7 蛋白免疫印迹（Western Blot）法检测大鼠腓肠肌MMP-1、TIMP-1的蛋白表达情况 取大鼠损伤区域腓肠肌组织，迅速加入液氮1 h后研磨，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂配平，经离心震荡后取上清液测定蛋白浓度。蛋白经95℃煮10 min，用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）恒压电泳，转膜至聚偏氟乙烯（PVDF），5%脱脂奶粉常温封闭1 h，加入经三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-HCl）缓冲盐溶液和吐温（Tween）-20稀释的一抗，4℃摇床过夜。TBST洗膜3次后加入5%脱脂奶粉的二抗，室温反应2 h，TBST洗膜，加ECL显色3 min，成像系统显影成像。以GDPH为内参照蛋白，运用image J软件进行定量分析。

1.8 统计学分析 运用SPSS24.0软件进行采集数据的整理分析。数据呈正态分布，实验数据用均数±标准差（±s）来表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 实验结果

2.1 HE染色结果分析 对照组大鼠肌纤维排列整齐，形态结构完整，肌细胞核呈卵圆形，多个核细胞位于肌细胞边缘。模型组大鼠肌纤维排列紊乱，部分肌纤维出现断裂情况，并伴有炎症细胞侵袭，肉眼可见形成大量结缔组织给予推拿治疗后，治疗组大鼠肌纤维排列较为整齐，伴有轻微肿胀，结构大小均一，结缔组织生成较少，纤维化程度明显降低，表明推拿治疗可有效修复大鼠急性骨骼肌钝挫伤后的肌肉损伤。

图1 大鼠腓肠肌HE染色（100×）

2.2 荧光定量PCR结果分析 对比对照组，造模28 d后模型组大鼠造模区域腓肠肌MMP-1的mRNA相对表达量及MMP-1/TIMP-1的比值明显降低（P＜0.05），TIMP-1的mRNA相对表达量明显升高（P＜0.05），说明模型大鼠致纤维化的进程与MMP-1的转录下调、TIMP-1的激活及MMP-1/TIMP-1比值下降有关。经25 d的推拿干预治疗后MMP-1的mRNA相对表达量及MMP-1/TIMP-1的比值较模型组明显升高（P＜0.05，P＜0.01），TIMP-1的转录水平明显降低（P＜0.05），说明推拿干预可能通过提升MMP-1的转录水平、升高MMP-1/TIMP-1的比值及降低TIMP-1转录水平来逆转大鼠钝挫伤导致的骨骼肌纤维化程度。

表1 各组腓肠肌MMP-1、TIMP-1的mRNA相对表达量及MMP-1/TIMP-1的比值

2.3 Western Blot结果分析 如表2所示，模型组大鼠造模区域腓肠肌组织中MMP-1的蛋白相对表达量及MMP-1/TIMP-1比值相比对照组均明显下调（P＜0.01）；TIMP-1的蛋白相对表达量明显上调。而经推拿干预治疗后，其MMP-1的蛋白相对表达量及MMP-1/TIMP-1比值相比模型组均明显提升（P＜0.01），TIMP-1的蛋白相对表达量明显下调，进一步说明推拿干预治疗可能通过提升MMP-1的蛋白水平、下调TIMP-1的蛋白水平及提升MMP-1/TIMP-1比值弱化大鼠钝挫伤导致的骨骼肌纤维化程度。

图2 各组大鼠腓肠肌MMP-1、TIMP-1相关蛋白印迹图

表2 各组腓肠肌MMP-1、TIMP-1的蛋白表达量及MMP-1/TIMP-1的比值

3 讨论

骨骼肌纤维化是一个多细胞因子参与调控的复杂病例变化过程，是骨骼肌纤维损伤重构后发生的病理表现形式[6-7]。

由外部原因造成的骨骼肌钝挫伤，会导致部分通路暂时激活或限制，并通过精确协调，来完成肌肉成分的重建，如损伤严重，会造成受伤组织动态平衡重建受阻，使正常肌纤维被不具备功能性的结缔组织替代。肌束膜是结缔组织的重要组成部分，其主要成分是I型、III型胶原，而I型胶原的过度沉积标志着受伤机体结缔组织大量合成，而这也会导致受损部位ECM的增多[8]。从目前的研究结果中可以推断，严重钝挫伤的肌肉组织在其后续修复过程中会引起I型、III型胶原的过度合成，进而导致瘢痕产生，严重影响肌肉的物理特性。研究发现，经受严重钝挫伤后，受损部位III型胶原蛋白水平迅速上升，并于14 d时达到峰值，而I型胶原蛋白水平于损伤后21 d时达到峰值，因此可以推断，钝挫伤后骨骼肌前期主要以III型胶原合成为主，而后期则以I型胶原合成为主[9]。

MMPs，即基质金属蛋白酶，作为主要的基质降解酶，可降低多种细胞外基质，截至目前，MMPs大家族已发现26个具备相似结构的成员[10-13]。MMPs表达水平升高有助于损伤部位形成新的肌纤维。MMP1作为家族成员之一，属于间质胶原酶，经研究表明，MMP1作为降解I型和III型胶原的特异性酶，具备缓解骨骼肌纤维化的作用，并能促进骨骼肌结构与功能的恢复。TIMPs（即基质金属蛋白酶抑制物），作为MMPs的特异性抑制剂，以共价键的形式结合MMPs并抑制其活性[13]。目前，TIMPs家族已发现4名成员，其中TIMP-1为MMP-1的内源性抑制物，其以1∶1的方式与MMP-1结合并形成复合体，最终使MMP-1失去活性。MMP-1/TIMP-1的动态平衡，极大的影响着MMP-1降解细胞外基质的功效。而本实验的研究结果表明，经严重钝挫伤后的腓肠肌组织其MMP-1的蛋白相对表达量的明显下调及其内源性抑制物TIMP-1的显著上调，必然导致MMP-1/TIMP-1比值下调，而MMP-1与TIMP-1动态平衡的破坏将会引起I型、III型胶原合成降解的稳态失衡，使I型、III型胶原合成增多，弱化MMP-1对细胞外基质（ECM）的降解作用，而ECM作为一种大分子物质，当骨骼肌纤维受损时，可由细胞内分泌到细胞外间质中，在骨骼肌纤维的连接中承担桥梁作用。ECM的大量外溢、增生、取代正常骨骼肌细胞可视为骨骼肌纤维化的重要标志[14]，因此可以推断，严重钝挫伤造成的受损部位肌肉组织中MMP-1/TIMP-1比值下调，是造成本实验模型组大鼠腓肠肌组织纤维化的重要因素。在其他学者的研究中，也发现了类似趋势[15]。杨宁等[16]研究发现，拉伤诱导骨骼肌纤维化模型大鼠腓肠肌组织的MMP-1/TIMP-1蛋白比值较正常组明显下降；Lv S研究发现，主动脉狭窄诱导心肌纤维化模型大鼠心肌组织的MMP-1/TIMP-1平衡受到破坏[17]；李洁等研究发现在肝纤维化小鼠肝组织MMP-1显著降低，TIMP-1显著升高[18]。由此可见，MMP-1/TIMP-1的失衡是引起骨骼肌纤维化的重要分子基础。

推拿治疗直接作用于受损骨骼肌，可活血化瘀、理筋复脉、调理经络，对于急性骨骼肌损伤后再生具有明显的效果[19-21]，而按摩时机与力度的选择也是影响干预效果的重要因素，在急性损伤期由于损伤的肌纤维破裂、坏死、和炎症细胞的浸润，不宜立即施术，故本实验按摩干预选择在大鼠成模3 d后，为急性损伤中期，此时期受损腓肠肌炎症反应加剧，成纤维细胞增多，新生的毛细血管与肉芽组织正在形成，推拿可有效改善局部血液循环，促进淤血的吸收与坏死组织的清除，并可避免损伤组织的肌肉粘连，能有效的促进损伤肌肉的修复。而在推拿力度的选择上，本实验通过推拿手法测定仪的前期手法训练，对王金贵教授手法进行复刻，通过按揉法降低受损部位淤结、肿胀，垂直用力，对受损肌纤维施以垂直按压，在早期施以小强度按摩，于后期加大按摩力度，从实验结果来看取得了较好的效果。在本实验中，通过HE染色观察发现，经按揉法干预，治疗组大鼠腓肠肌纤维排列较整齐且间隙小、胶原纤维沉积降低、ECM增生减少、纤维化程度明显降低。而qPCR和Western Blot结果显示经按揉法干预后大鼠腓肠肌MMP-1的表达及MMP-1/TIMP-1比值明显上调，TIMP-1的表达明显下调从而抑制了骨骼肌纤维化的形成。而其他学者的研究也表明推拿可促进肌纤维再生及肌卫星细胞增殖，改善损伤区血液循环等加速骨骼肌损伤后修复[22-24]。由此推论，推拿可能是因为使腓肠肌损伤部位发热、促进其血液循环、增加血管容积、改善了腓肠肌受损部位微循环，使受损部位修复所需要的氧和营养物质得到大量补充，并降低与周围组织的粘连，使慢性炎症反应得到缓解，在提升MMP-1表达的同时，降低TIMP-1的表达，使MMP-1/TIMP-1比值提升，进一步提升了MMP-1降解I型和III型胶原的效果，进而抑制纤维化的发生。

4 小结

结合HE染色形态学观察，本研究所采用的钝挫伤造模方式明显引起了部分肌纤维断裂，肉眼可见形成大量结缔组织。而通过qPCR及Western Blot结果分析，MMP-1mRNA及蛋白表达下调，TIMP-1mRNA及蛋白表达上调，MMP-1/TIMP-1比值下降，并引起受损部位腓肠肌出现明显纤维化症状。而经过推拿干预后，治疗组大鼠受损部位腓肠肌肌纤维结构、大小均一，结缔组织生成降低，纤维化程度明显降低。MMP-1mRNA及蛋白表达明显上调，TIMP-1mRNA及蛋白表达明显下调，提升了MMP-1/TIMP-1比值，推测推拿治疗可能通过改变MMP-1与TIMP-1动态平衡，进而，有效降低I型和III型胶原纤维的增生，促进肌肉的修复，降低受损肌肉纤维化程度。

综上所述，推测按摩通过提升MMP-1/TIMP-1比值，有效缩短肌纤维修复过程，这可能为推拿促进骨骼肌损伤修复，降低纤维化的机制之一。